เมื่อประมาณกลางเดือนกุมภาพันธ์ที่ผ่านมา ได้มีโอกาสไปบรรยายเล่าประสบการณ์ การออกแบบอุปกรณ์ทำการทดลอง, การเก็บตัวอย่าง และการแปลผลการทดลอง ให้กับนักวิจัยที่สถาบันแห่งหนึ่งฟัง หลังเสร็จสิ้นการบรรยายก็มีนักวิจัยท่านหนึ่งมาปรึกษาเรื่องพีคที่ได้จากเครื่อง HPLC (High Perfomance Liquid Chromatograph) นั้นออกมาที่เวลาไม่คงที่ ทั้งนี้ที่ตั้งค่าพารามิเตอร์ทุกอย่างเหมือนเดิม
กล่าวคือเขาทำการวิเคราะห์ด้วยวิธีที่กำหนดไว้ในมาตรฐาน ไม่ว่าจะเป็นชนิดคอลัมน์หรือ solvent (ซึ่งก็คือmobile phase) ที่ใช้ และสภาวะการวิเคราะห์ (อุณหภูมิ และอัตราการไหลของ mobile phase) สิ่งที่เขาพบก็คือเมื่อเริ่มเปิดเครื่องครั้งแรกแล้วรอจนระบบเข้าที่ การวิเคราะห์ตัวอย่างครั้งแรกจะไม่มีปัญหาอะไร แต่เมื่อวิเคราะห์ตัวอย่างเดิมซ้ำพบว่าเวลาที่พีคออกมานั้นเปลี่ยนแปลงไปอย่างมีนัยสำคัญ และก็มักจะทำซ้ำไม่ค่อยได้
คำถามหนึ่งที่ผมถามเขาคือมีการใช้เทคนิค solvent gradient หรือเปล่า ซึ่งเขาก็บอกว่ามีการใช้ ผมก็ให้คำแนะนำเขาไปว่าปัญหาอาจอยู่ตรงที่หลังจากสิ้นสุดการวิเคราะห์แล้ว ยังรอไม่นานพอให้ระบบกลับคืนสู่ที่เดิม เมื่อเริ่มวิเคราะห์ครั้งที่สอง สภาวะการวิเคราะห์นั้นแตกต่างจากการวิเคราะห์ครั้งแรก ทำให้เวลาที่พีคออกมานั้นเปลี่ยนแปลงไป ซึ่งผมก็เคยเจอปัญหาทำนองนี้เวลาที่ใช้เทคนิค temperature programmed กับ GC (Gas chromatograph)
แต่ก่อนอี่นมาทำความรู้จักการทำ solvent gradient (หรือ gradient elution) กันหน่อยก่อนดีกว่า (รูปที่ ๑)
solvent ที่ใช้ในการวิเคราะห์ด้วย HPLC ถ้าใช้ solvent ที่มีองค์ประกอบคงที่ (ซึ่งอาจเป็นสารบริสุทธิ์หรือสารผสมที่มีสัดส่วนการผสมคงที่) จะเรียกว่า isocratic elution แต่ในกรณีที่พบว่าการแยกสารนั้นออกมาไม่ค่อยดี ก็อาจแก้ปัญหานี้ด้วยการให้ solvent มีองค์ประกอบที่เปลี่ยนไประหว่างการวิเคราะห์ เช่นถ้าพบว่าสาร X นั้นละลายใน solvent A ได้ดีในขณะที่สาร Y นั้นละลายใน solvent A ได้ไม่ดี แต่สาร Y ละลายใน solvent B ได้ดีกว่า ดังนั้นในช่วงแรกของการวิเคราะห์ก็จะใช้ solvent ที่มีสัดส่วนของ A สูงเพื่อให้ X นั้นไหลพ้นคอลัมน์ออกมาในขณะที่ Y นั้นยังคงค้างอยู่บน stationary phase ในคอลัมน์ จากนั้นจึงค่อย ๆ เพิ่มสัดส่วนของ B ใน solvent ที่ใช้นั้นให้สูงขึ้นเพื่อชะเอา Y ออกจากคอลัมน์ (ช่วง Gradient ในรูปที่ ๑) และเมื่อสิ้นสุดการวิเคราะห์ (สิ้นสุดช่วง Flush out) ก็จะปรับสัดส่วน A และ B นั้นกลับมายังค่าเริ่มต้นอีกครั้ง (ช่วง Re-equilibration) และเมื่อระบบกลับคืนสู่สภาพเดิมก็จะเริ่มต้นการวิเคราะห์ใหม่ได้
จุดที่ผมให้คำแนะนำเขาไปคือช่วงเวลา Re-equilibration ที่เขาตั้งไว้นั้นอาจจะนานไม่พอ โดยพิจารณาจากขนาดคอลัมน์และอัตราการไหลของ solvent ที่เขาใช้
ขอย้อนกลับไปยังการทำ temperature programmed ในกรณีของ GC นิดนึง คือเรามักใช้เทคนิคนี้ในการแยกสารที่มีจุดเดือดต่างกันมาก โดยในช่วงแรกจะเริ่มทำการวิเคราะห์ที่อุณหภูมิต่ำก่อนเพื่อให้สารที่มีจุดเดือดต่ำออกพ้นคอลัมน์ก่อน จากนั้นจึงค่อย ๆ เพิ่มอุณหภูมิคอลัมน์ให้สูงขึ้นเพื่อไล่สารที่มีจุดเดือดสูงออกจากคอลัมน์ และเมื่อสิ้นสุดการวิเคราะห์แล้วก็จะลดอุณหภูมิคอลัมน์กลับลงที่เดิม (ค่าเริ่มต้น) แล้วจึงค่อยทำการวิเคราะห์ใหม่
"อุณหภูมิคอลัมน์" ที่เรียกกันในการวิเคราะห์ด้วย GC นั้นแท้ที่จริงมันไม่ใช่อุณหภูมิของ "คอลัมน์" แต่เป็นอุณหภูมิของ "อากาศ" ที่อยู่ใน oven ที่ติดตั้งคอลัมน์เอาไว้ การเพิ่มอุณหภูมิคอลัมน์แท้จริงแล้วคือการเพิ่มอุณหภูมิให้กับอากาศใน oven แล้วให้อากาศนั้นถ่ายเทความร้อนใหักับคอลัมน์อีกที ในทางกลับกันการลดอุณหภูมิคอลัมน์แท้จริงแล้วคือการระบายอากาศร้อนใน oven ออกแล้วให้อากาศเย็นเข้าไปแทนที่ เมื่ออุณหภูมิของอากาศใน oven ลดลง ตัวคอลัมน์ก็จะถ่ายเทความร้อนให้กับอากาศรอบตัวมัน ตัวมันก็จะเย็นลง
แต่การเย็นตัวลงของคอลัมน์มันใช้เวลา อุณหภูมิอากาศใน oven นั้นอาจกลับมานิ่งที่ค่าเริ่มต้นแล้ว แต่อุณหภูมิของ stationary phase ในคอลัมน์นั้นยังสูงกว่าอุณหภูมิอากาศใน oven ดังนั้นถ้าทำการวิเคราะห์ต่อโดยไม่รอให้คอลัมน์เย็นตัวลงมาอยู่ที่อุณหภูมิเริ่มต้น ก็มักจะพบว่าพีคออกมาเร็วขึ้น
ในกรณีของ solvent gradient ที่เขาใช้ พมคาดว่าในขณะที่เขาเริ่มการวิเคราะห์ครั้งถัดไปนั้น ความเข้มข้นของ solvent ที่ตกค้างอยู่ในคอลัมน์นั้น ยังไม่กลับมายังสัดส่วนองค์ประกอบเริ่มต้น เพราะด้วยขนาดของคอลัมน์ที่ใหญ่และอัตราการไหลที่ต่ำ ทำให้เกิดการ back mixing ในคอลัมน์ ต้องใช้เวลาที่นานขึ้นในการให้ solvent ใหม่นั้นเข้าไปไล่ solvent เก่าออกให้หมด
ไม่กี่สัปดาห์หลังจากนั้นเขาก็แจ้งกลับมาว่าแก้ปัญหาได้แล้ว โดยช่างของทางบริษัทที่จำหน่ายเครื่องบอกว่าเป็นเพราะคอลัมน์ "ตัน" เห็นได้จากความดันที่ใช้ (ในการทำให้ solvent ไหลผ่านคอลัมน์ด้วยอัตราการไหลคงที่) ตอนสิ้นสุดการวิเคราะห์นั้นสูงกว่าตอนเริ่มต้น เมื่อรอให้ความดันนั้นกลับมายังค่าเดิม ก็สามารถทำการวิเคราะห์ซ้ำได้
ผมเองนั้นมองว่าคำอธิบายที่ว่าคอลัมน์ "ตัน" นั้นมันไม่มีเหตุผลรองรับ นั่นก็เพราะ solvent ที่ใช้ก็เป็นของเหลวที่มีความบริสุทธิ์สูง (HPLC grade) และตัวอย่างนั้นก็เป็นของเหลว (ที่ฉีดเข้าไปในปริมาตรที่น้อยเมื่อเทียบกับอัตราการไหลของ solvent) สาเหตุที่ทำให้เห็นว่าความดันในระหว่างการวิเคราะห์นั้นเปลี่ยนไปนั้นเป็นเพราะ "ความหนืด" ของ solvent ที่เปลี่ยนไปเมื่อส่วนผสมเปลี่ยนไปมากกว่า
คือเมื่อตรวจสอบแล้วพบว่า solvent เริ่มต้นที่เขาใช้นั้นมี "ความหนืด" ที่ต่ำกว่า solvent ตัวที่สองที่ค่อย ๆ ผสมเข้าไปใน solvent ตัวแรกเมื่อเริ่มทำการวิเคราะห์ ทำให้ความหนืดของ solvent ผสมที่ไหลผ่านคอลัมน์เพิ่มขึ้นเรื่อย ๆ ปั๊มเลยต้องใช้ความดันที่สูงขึ้นเพื่อดันให้ solvent ผสมไหลผ่านคอลัมน์ด้วยอัตราการไหลคงเดิม ที่นี้พอการวิเคราะห์สิ้นสุดก็ทำการป้อน solvent ตัวแรกกลับเข้าไปในคอลัมน์ใหม่ พอ solvent ที่ตกค้างอยู่ในคอลัมน์กลับกลายเป็น solvent ตัวแรกหมด ความหนืดก็กลับมายังค่าเดิม ความดันที่ต้องใช้ในการดันให้ solvent ไหลผ่านคอลัมน์ที่อัตราการไหลเดิมก็กลับมายังค่าเดิม