วันอาทิตย์ที่ 23 สิงหาคม พ.ศ. 2552

ทำความรู้จักกับ Chromatogram (ตอนที่ 2) MO Memoir : วันศุกร์ที่ ๑๐ กรกฎาคม ๒๕๕๒

ก่อนอื่นต้องของแสดงความยินดีกับสมาชิกของกลุ่มที่เข้ารับพระราชทานปริญญาบัตร (ทั้งมหาบัณฑิตและดุษฎีบันฑิต) ไปเมื่อวานนี้ (พฤหัสบดีที่ ๙ กรกฎาคม) หวังว่าทุกคนจะได้ดำเนินชีวิตต่อไปดังที่ตนเองปราถนา

MO Memoir ฉบับนี้เป็นฉบับขึ้นปีที่ ๒ แล้ว (ฉบับแรกออกเมื่อวันพุธที่ ๙ กรกฎาคม ๒๕๕๒) นับดูปีแรกก็ได้ออกไปทั้งสิ้น ๔๒ ฉบับ รวม ๑๔๖ หน้า ส่วนเรื่องอะไรบ้างนั้นก็ขอให้ดูในดัชนีที่แนบมาด้วยก็แล้วกัน

เนื้อหาใน MO Memoir ฉบับนี้ต่อเนื่องจาก MO Memoir 2552 July 3 Fri ทำความรู้จักกับ Chromatogram (ตอนที่ 1) ในตอนที่แล้วได้กล่าวถึงหลักการในการแปลงสัญญาณที่วัดได้ให้เป็นสมการคณิตศาสตร์ เพื่อที่จะระบุตำแหน่งที่เริ่มเกิดพีค ตำแหน่งสูงสุดของพีค และตำแหน่งสิ้นสุดของพีค ส่วนในตอนนี้จะกล่าวถึงการรายงานผลและตัวอย่างโครมาโทแกรมที่ได้จากการวิเคราะห์จริง และสิ่งที่ต้องระวังในการอ่าน

ตัวอย่างที่กล่าวถึงจากจุดนี้ไปจะอาศัยผลการวิเคราะห์ที่ใช้โปรแกรมการคำนวณและวิเคราะห์ผลของเครื่องอินทิเกรเตอร์ Shimadzu ที่ใช้อยู่ในแลปเป็นหลัก ขอย้ำว่าอุปกรณ์ต่างยี่ห้อหรือต่างรุ่นกัน ตัวโปรแกรมวิเคราะห์และรายงานผลไม่จำเป็นต้องเหมือนกันเสมอไป

เนื่องจากสัญญาณที่ได้จากการวัดนั้นอาจมีความไม่ราบเรียบ (ซึ่งมักเป็นเรื่องปรกติ) ดังนั้นในการรายงานผลเพื่อไม่ให้เครื่องรายงานสัญญาณที่ไม่ราบเรียบนั้นออกมาเป็นพีคนั้น ตัวโปรแกรมจึงได้เปิดช่องให้สามารถกำหนด "พื้นที่ของพีค" หรือ "ความสูงของพีค" ที่น้อยที่สุดที่จะพิมพ์รายงานออกมา ซึ่งโดยปรกติมักต้องกำหนดทั้งสองเงื่อนไข สัญญาณบางชนิดเช่นสัญญาณรบกวนที่เป็น impulse เข้ามาในระบบนั้นจะมีลักษณะปรากฏเป็นพีคที่สูงแต่แคบ (ความกว้างถือว่าเป็นศูนย์หรือเกือบเป็นศูนย์) ดังนั้นพื้นที่ใต้กราฟจึงน้อยมาก ถ้าเรากำหนดพารามิเตอร์ดังกล่าวให้มีขนาดใหญ่เกินไป เราก็จะมองไม่เห็นพีคเล็ก ๆ ที่เกิดขึ้นและอาจมองไม่เห็นผลิตภัณฑ์ที่เกิดขึ้นได้ (ปัญหานี้มักจะเกิดในกรณีที่เราทำการทดลองที่มีค่า conversion ต่ำ หรือมองหาผลิตภัณฑ์ข้างเคียงที่มีค่า selectivity ที่ต่ำ) แต่ถ้าเรากำหนดไว้น้อยเกินไปจะทำให้มีการรายงานผลพีคที่ไม่ได้เกิดจากสารตัวอย่างปรากฏออกมาด้วย

รูปที่ 1 แสดงตัวอย่างของพีคที่ปรากฏบนโครมาโทแกรม แต่ไม่มีการพิมพ์รายงานออกมา (A) ถ้าเราพิจารณาโครมาโทแกรมจะเห็นว่าควรมีพีคอีก 3 พีคที่ตำแหน่งเวลาประมาณ 18 นาที 21 นาทีและ 24 นาที แต่เนื่องจากพีคมีขนาดเล็กและเตี้ย เครื่องก็เลยไม่พิมพ์ผลการคำนวณที่ได้ออกมา (ในความเป็นจริงพีคที่ 3 ตำแหน่งนี้เป็นของผลิตภัณฑ์ที่ต้องการวิเคราะห์) แต่ในรูปที่ 2 มีการรายงานว่ามีพีคที่ตำแหน่งเวลาประมาณ 18 นาทีและ 21 นาที แต่ไม่มีการรายงานว่ามีพีคที่ตำแหน่งเวลาประมาณ 24 นาที ทั้ง ๆ ที่โครมาโทรแกรมแสดงให้เห็นว่าพีคที่ตำแหน่ง 24 นาทีนั้นไม่ได้มีขนาดเล็กไปกว่าพีคที่ตำแหน่ง 18 นาทีหรือ 21 นาทีเลย ในความเป็นจริงนั้นพบว่าถ้านำพีคที่ตำแหน่งเวลา 18 นาที 21 นาทีและ 24 นาทีไปทำการแยกพีคและคำนวณพื้นที่ของแต่ละพีคใหม่ จะพบว่าพีคที่ตำแหน่งเวลา 24 นาทีนั้นมีพื้นที่มากกว่าพีคที่เวลา 21 นาทีอีก

ต่อไปขอให้พิจารณาพื้นที่และความสูงของพีคที่ตำแหน่งเวลา 0.93-0.94 นาทีในรูปที่ 1 และ 2 จะเห็นว่าพื้นที่ใต้พีคที่รายงานในรูปที่ 2 มีค่าประมาณ 2/3 ของพื้นที่ใต้พีคของรูปที่ 1 แต่ความสูงของพีคทั้งสองเท่ากับ (ประมาณ 1,225,000) ลักษณะดังกล่าวเป็นลักษณะที่แสดงการ "อิ่มตัว" ของ detector กล่าวอีกนัยหนึ่งคือปริมาณตัวอย่างนั้นมากเกินกว่าความสามารถของ detector ที่จะตรวจวัดได้ ปรากฏการณ์นี้เสมือนกับการที่เราเอาของหนัก 10 กิโลกรัมหรือมากกว่าไปวางบนตาชั่งที่ชั่งน้ำหนักได้เต็มที่ 10 กิโลกรัม เราก็จะเห็นตาชั่งแสดงตัวเลขน้ำหนักสูงสุดที่ 10 กิโลกรัมเหมือนกันหมด ทั้ง ๆ ที่ของแต่ละชิ้นนั้นหนักไม่เท่ากัน แต่พีคที่ตำแหน่งเวลาประมาณ 1.8 และ 3.9 นาทีนั้น แม้ว่าไม่ปรากฏในรูปกราฟ แต่ตัวรายงานที่พิมพ์ออกมาก็แสดงให้เห็นว่าพื้นที่ของพีคและความสูงของพีคนั้นเปลี่ยนแปลงไปในทิศทางเดียวกัน (พีคที่สูงกว่าก็มีพื้นที่มากกว่าพีคที่เตี้ยกว่า) ลักษณะเช่นนี้แสดงว่าสัญญาณที่เครื่องใช้ในการวาดโครมาโทแกรมและสัญญาณที่นำไปคำนวณพื้นที่และความสูงของพีคนั้นเป็นคนละสัญญาณกัน

พีคที่ตำแหน่ง 1.27 นาที (B) ในรูปที่ 2 นั้นไม่มีรายงานปรากฏในรูปที่ 1 แต่ถ้านำพื้นที่ของพีคที่ตำแหน่ง 0.94 นาทีและ 1.27 นาทีมารวมกัน ก็จะได้พื้นที่ใกล้เคียงกับพีคที่ตำแหน่งเวลา 0.933 ของรูปที่ 1 (D) การแปลผลรายงานดังกล่าวควรต้องใช้ความระมัดระวัง การที่เห็น 2 พีคในรูปที่ 2 นั้นมีสาเหตุได้หลายสาเหตุ เช่นตัวอย่างที่ทำการฉีดในรูปที่ 2 นั้นมีสารประกอบอื่นที่ไม่มีในตัวอย่างที่ฉีดในรูปที่ 1 หรือในระหว่างที่ทำการกดฉีดสารในรูปที่ 2 นั้นมีการหยุดชะงัก ไม่ได้เป็นการกดฉีดเข้าไปทีเดียวจนหมดเข็ม ทำให้การฉีดสารเป็นเสมือนการฉีดตัวอย่าง 2 ครั้งเข้าไปติด ๆ กัน พีคแรก (เวลา 0.94 นาที) เกิดจากการฉีดเข้าไปครั้งแรก ส่วนพีคที่สองนั้น (เวลา 1.27 นาที) เกิดจากการฉีดสารที่เหลือค้างอยู่ในเข็มเข้าไปจนหมด เหตุการณ์ดังกล่าวมักเกิดกับพีคที่ออกมาตอนแรก ๆ เพราะพีคเหล่านี้มีลักษณะที่แหลมและคม แต่จะไม่เห็นกับพีคในช่วงหลังเพราะพีคในช่วงหลังจะแผ่กว้างออกมากว่า ทำให้ความแตกต่างถูกลบหายออกไป

ส่วนหนึ่งของรายงานที่นิสิตมักไม่ให้ความสนใจทั้ง ๆ ที่เป็นตัวสำคัญที่จะบอกว่าพื้นที่/ความสูงที่เครื่องรายงานออกมานั้นน่าเชื่อถือหรือไม่คือวิธีการลากเส้น base line (C) สำหรับเครื่อง Shimadzu ที่เราใช้นั้น ถ้าการคำนวณนั้นไม่ได้ใช้ base line เส้นเดิมที่ใช้ในตอนเริ่มการวัด จะใช้วิธีพิมพ์สัญลักษณ์กำกับว่าการลาก base line และการแบ่งพีคนั้นใช้วิธีการใด ตัวอย่างเช่นกรณีของพีคเล็กที่อยู่บนหางของพีคใหญ่ (พีคที่ตำแหน่งเวลาประมาณ 18 นาที 21 นาทีและ 24 นาที ซึ่งอยู่บนหางของพีคที่เวลา 0.94 นาที) การคำนวณพื้นที่/ความสูงควรต้องวัดจากส่วนหางของพีคใหญ่ ไม่ใช่วัดจากเส้น base line

เมื่อสัก 10 กว่าปีที่แล้ว (ก่อนปี 2540) เคยมีเหตุการณ์ที่นิสิตพบว่าสารที่ออกมาจาก reactor นั้นมีปริมาณน้อยกว่าสารที่ป้อนเข้า reactor ทำให้มีการเสนอแนวความคิดว่าสารตั้งต้นเกิดเป็น coke สะสมบนตัวเร่งปฏิกิริยา แต่เมื่อวัดปริมาณ coke ที่เกิดแล้วก็พบว่ายังมีมวลสารหายไปอีก นิสิตคนดังกล่าวนำปัญหานี้มาปรึกษากับผม ผมก็ของดูโครมาโทรแกรมของการวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ เท่านั้นเองก็ได้คำตอบ เพราะโครมาโทแกรมแสดงให้เห็นว่าเขาได้ผลิตภัณฑ์สองตัวที่พีคไม่แยกจากกันชัดเจนดังแสดงในรูปที่ 3 แต่เครื่องไปลาก base line ตามแนวเส้นสีเขียว ทำให้พื้นที่พีคที่อยู่ใต้เส้นสีเขียวแต่อยู่เหนือเส้นระดับ base line ที่แท้จริงหายไป จึงทำให้เห็นว่ามวลสารบางส่วนหายไป


รูปที่ 3 การลาก base line ที่ไม่ถูกต้อง ทำให้การคำนวณพื้นที่และความสูงของพีคผิดพลาด

ในอดีตนั้นการแก้ปัญหาดังกล่าวมักต้องไปทำที่การปรับเครื่อง GC ให้แยกพีคทั้งสองออกจากกันให้ได้ก่อน แต่ถ้าไม่สามารถปรับแต่งที่ตัวเครื่องได้ก็ต้องมาแก้ปัญหาที่ผลที่พิมพ์ออกมา (ตัดกระดาษโครมาโทแกรมที่ได้แล้วไปชั่งน้ำหนัก) แต่ในปัจจุบันการแก้ปัญหาที่เกิดตามรูปที่ 3 ทำได้ง่าย (ถ้าตั้งใจทำ) ด้วยการเซฟข้อมูลโครมาโทแกรมเก็บเอาไว้ ถ้าพบว่าตัวเลขในรายงานมีปัญหา เราก็สามารถนำข้อมูลที่เซฟเก็บไว้นั้นมาทำการประมวลใหม่ด้วยโปรแกรม fityk ที่กลุ่มเราใช้กันอยู่ (เอาไว้วันหลังจะเล่าให้ฟังเป็นลายลักษณ์อักษรเสียทีว่าทำไมในกรณีนี้จึงใช้ฟังก็ชัน Split Gaussian) จะได้ไม่ต้องไปทำการทดลองใหม่ทั้งหมด

เครื่อง GC และอินทิเกรเตอร์ (Integrator) ของ Shimadzu ที่เราใช้นั้นสามารถทำการปรับความว่องไวของ detector ได้ที่การปรับช่วง range ถ้าจะยกตัวอย่างให้เห็นได้ง่าย ๆ ก็ขอให้นึกถึง multi meter ที่เราใช้วัดทั้งความต้านทางและความต่างศักย์ในงานไฟฟ้า เรามีมิเตอร์เพียงเครื่องเดียวแต่เราก็สามารถตั้งให้มันวัดเต็มสเกลที่ 1.5 V หรือ 220 V ก็ได้ ถ้าเราตั้งให้มันวัดเต็มสเกลที่ 1.5 V เราจะวัดความต่างศักย์ในช่วงนี้ได้ละเอียด แต่ถ้านำไปวัดที่ความต่างศักย์สูงกว่า 1.5 V มิเตอร์ก็จะตีเต็มสเกล (เผลอ ๆ อาจพังได้) แต่ถ้าเราตั้งให้วัดที่ความต่างศักย์เต็มสเกล 220 V เราก็สามารถนำไปใช้วัดไฟตามบ้านได้ แต่ถ้านำมาวัดว่าถ่านไฟฉาย 1.5 V นั้นไฟหมดหรือยัง เราจะไม่เห็นเข็มมันกระดิกแม้ว่าถ่านไฟฉายก้อนนั้นจะมีไฟเต็มก็ตาม ในการวิเคราะห์ด้วย GC ก็เช่นเดียวกัน ถ้าเราต้องการตรวจหาสารที่มีอยู่น้อยในตัวอย่าง เราก็ต้องตั้งเครื่องให้มีความว่องไวสูง (ใช้ค่า range ที่ต่ำ) เพื่อที่จะได้มองเห็นสารนั้นได้

นอกจากนี้ยังสามารถปรับขนาดสัญญาณได้ที่ปุ่ม (หรือตัวโปรแกรม) ที่เขียนว่า attenuation ได้อีก (attenuation แปลว่าการทำให้อ่อนลง) ส่วนการปรับที่ปุ่มนี้จะส่งผลต่อการวาดกราฟหรือการคำนวณพื้นที่ด้วยหรือเปล่านั้นต้องไปทดลองกับเครื่องเอง เพราะบางเครื่องก็ส่งผล บางเครื่องก็ไม่ส่งผล

นิสิตจำนวนไม่น้อย (หรือว่าเกือบทั้งหมด ?) ของนิสิตในแลปจะอ่านเฉพาะตัวเลขพื้นที่พีคเท่านั้นโดยไม่สนใจส่วนที่เหลือที่เครื่องพิมพ์ออกมา ที่แปลกก็คือถ้าสนใจเฉพาะตัวเลขเท่านั้น ทำไมไม่กำหนดให้เครื่องพิมพ์เฉพาะตัวเลขออกมาโดยไม่ต้องวาดกราฟ จะได้ไม่เปลืองกระดาษ แต่ก็อย่างว่านั่นแหละ ในเมื่อไม่ได้เป็นคนออกเงินซื้อของใช้เอง จะต้องไปสนใจทำไมว่าอะไรมันจะสิ้นเปลืองไปเท่าใด


รูปที่ 1 โครมาโทแกรมที่แสดงพีค แต่ไม่รายงานผล 3 พีคหลัง


รูปที่ 2 โครมาโทแกรมที่แสดงพีคแรกว่าประกอบด้วยหลายพีคย่อย

ไม่มีความคิดเห็น: