MO ตอบคำถาม สารพัดปัญหาโครมาโทแกรม MO Memoir : Sunday 4 August 2556

ช่วงสัปดาห์สุดท้ายของเดือนที่แล้ว มีอีเมล์จากผู้อ่านสองรายเขียนเข้ามาถามเรื่องปัญหา GC ซึ่งถ้าทางผมพอจะให้ความช่วยเหลือได้ก็จะตอบกลับไป แต่ส่วนใหญ่จะให้ได้แค่คำแนะนำว่าควรต้องตรวจสอบอะไรบ้าง เพราะบางทีคำถามมันก็กว้างเหลือเกิน (ไม่มีข้อมูลประกอบ) เหมือนกับคนไข้บอกกับหมอว่ามีอาการปวดหัวกับตัวร้อน แล้วถามว่าเป็นโรคอะไร 

 

แต่การตอบคำถามเช่นนี้บางทีมันก็สนุกดีเหมือนกัน (ผมเจอเป็นประจำ) เพราะมันเหมือนกับการฝึกให้เรามองความเป็นไปได้ทั้งหมดให้ได้ก่อนเพื่อตั้งสมมุติฐาน จากนั้นจึงค่อยควานหาข้อมูลเพิ่มเติมว่าสมมุติฐานข้อไหนมันไม่น่าจะเป็น ข้อไหนยังมีความเป็นไปได้อยู่ ก็เลยขอเอาเรื่องราวเหล่านี้มาเล่าสู่กันฟัง

เริ่มจากรายแรกก่อน ฉบับแรกส่งมาเมื่อวันพุธที่ ๒๔ กรกฎาคม ๒๕๕๖

สวัสดีค่ะ

ดิฉันเป็นนักศึกษาที่ใช้เครื่อง GC-FID (อยู่คนละมหาลัยกับอาจารย์ค่ะ)

รบกวนขอคำปรึกษาเรื่องพีคประหลาดที่อาจารย์ได้เขียนลงในบล๊อคเมื่อไม่นานมานี้ ดิฉันพบปัญหาเช่นเดียวกันค่ะ คือมีพีคประหลาดเล็ก ๆ ขึ้นเป็นระยะ ๆ

แต่ของดิฉัน บางครั้งขึ้นที่ช่วงอุณหภูมิสูง บางครั้งขึ้นตั้งแต่อุณหภูมิต่ำเลย แต่บางครั้งก็ไม่ขึ้นเลย กรณีนี้ฉีด solvent อย่างเดียวเลยนะคะ

เคยสงสัยว่าเป็นที่ septum แต่ลองลดอุณหภูมิ injector ลงพีคก็ยังไม่หายค่ะ

ไม่ทราบว่าอาจารย์พอมีคำแนะนำแก้ไขปัญหานี้ไหมคะ

ขอบพระคุณมากค่ะ

คำถามอย่างนี้ตอบยากที่ตรงที่ไม่มีรูปพีคมาให้ดู เพราะรูปทรงของพีคพอจะบอกอะไรได้บ้าง ทั้งพีคที่ออกมาที่อุณหภูมิสูงและอุณหภูมิต่ำ

คำตอบที่ให้ตรงนี้ต้องระวังถ้าจะนำไปใช้กับระบบที่ detector นั้นตอบสนองต่อการเปลี่ยนแปลงอัตราการไหลของ carrier gas เช่นพวก ECD และ FPD ที่เราเจอมา เพราะเมื่อวาล์วฉีดตัวอย่างหรือ switching valve เปลี่ยนตำแหน่ง จะทำให้อัตราการไหลของ carrier gas เปลี่ยนแปลงไป ส่งผลให้เส้น base line มีการเปลี่ยนแปลงเกิดเป็นรูปร่างแบบพีคขึ้นมาได้ เรื่องนี้ทางกลุ่มเราประสบตอน set เครื่อง GC-2014 FPD และ GC-2014 ECD & PDD มาแล้ว (ดูตัวอย่างได้ใน Memoir ปีที่ ๔ ฉบับที่ ๓๓๙ วันจันทร์ที่ ๒๕ กรกฎาคม ๒๕๕๔ เรื่อง "GC-2014 ECD & PDD ตอนที่ ๑๐ ผลกระทบจากการเปลี่ยนตำแหน่งของวาล์วตัวที่ ๔" และปีที่ ๔ ฉบับที่ ๓๔๐ วันพุธที่ ๒๗ กรกฎาคม ๒๕๕๔ เรื่อง "GC-2014 ECD & PDD ตอนที่ ๑๑ ผลกระทบจากการเปลี่ยนตำแหน่งของวาล์วตัวที่ ๓")

โดยทั่วไปในกรณีของ packed column พีคที่ออกมาในช่วงแรกจะมีสัดส่วนความสูงต่อความกว้างที่มาก (สูงแต่แคบ) พีคออกตามหลังมาจะมีสัดส่วนความสูงต่อความกว้างที่ลดลง (เตี้ยและอ้วน) ที่ต้องบอกว่าเป็นกรณีของ packed column ก็เพราะถ้าเป็น capillary column เรียกได้ว่าพีคมันจะคม (สูงและแคบ) ตลอดทั้งโครมาโทแกรม

ถ้ามีพีคที่มีลักษณะสัดส่วนความสูงต่อความกว้างที่มาก แทรกอยู่ระหว่างหรือตามหลังพีคที่มีสัดส่วนความสูงต่อความกว้างที่ต่ำกว่า ก็น่าสงสัยว่ามีอะไรบางอย่างหลุดเข้าไปในคอลัมน์ภายหลังจากที่ฉีดตัวอย่างเข้าไปแล้ว

ถ้ามีพีคที่มีลักษณะสัดส่วนความสูงต่อความกว้างที่ต่ำ ปรากฏอยู่ระหว่างหรือปรากฎเป็นฐานให้กับพีคที่มีสัดส่วนความสูงต่อความกว้างที่มากที่ออกมาในช่วงต้น ก็น่าสงสัยว่าคงมีบางอย่างตกค้างอยู่ในคอลัมน์จากการวิเคราะห์ก่อนหน้า แต่เพิ่งจะมาออกเอาตอนนี้

ตัวอย่างที่เคยเจอมา

(ก) พีคเล็ก ๆ ลักษณะพีคได้สัดส่วน ออกมาเอาแน่เอานอนไม่ได้ ไม่ขึ้นกับอุณหภูมิคอลัมน์ เคยพบว่าปัญหาอยู่ที่ septum ทนอุณหภูมิไม่ได้ (ดู Memoir ปีที่ ๖ ฉบับที่ ๖๔๑ วันอังคารที่ ๙ กรกฎาคม ๒๕๕๖ เรื่อง "สารพัดปัญหา GC (การทำวิทยานิพนธ์ภาคปฏิบัติ ตอนที่ ๔๘)")

(ข) พีคใหญ่ป้าน ๆ ออกมาที่อุณหภูมิสูง เกิดจากสารที่ตกค้างในคอลัมน์ที่เกิดจากการฉีดครั้งก่อนหน้า (บางทีเกิดจากคนที่ทดลองเอาไว้ก่อน) พวกนี้ที่เคยเจอเกิดจากการตั้งอุณหภูมิคอลัมน์ต่ำเกินไป เลยตกค้างอยู่ในคอลัมน์ ใช้เวลานานในการเคลื่อนตัวออก ทำให้ผู้วิเคราะห์คิดว่าสารนั้นออกมาหมดแล้ว ทั้ง ๆ ที่ยังมีค้างอยู่ ปัญหานี้แก้ได้ด้วยการ regenerate column คือเปิด oven ทิ้งไว้ที่อุณหภูมิสูง (โดยที่คอลัมน์ยังทนได้) เพื่อไล่สารตกค้างออกมาให้หมด (ดู Memoir ปีที่ ๒ ฉบับที่ ๘๓ วันอังคารที่ ๑ ธันวาคม ๒๕๕๒ เรื่อง "เกิดขึ้นตอนกี่โมง")

(ค) นิสิตใช้ solvent ล้างเข็ม แต่ก่อนฉีดตัวอย่างไม่ได้ใช้สารตัวอย่างล้าง solvent ออกให้หมด ทำให้มีพีค solvent ปรากฏในโครมาโทแกรม (ดู Memoir ปีที่ ๕ ฉบับที่ ๕๙๗ วันพุธที่ ๒๗ มีนาคม ๒๕๕๖ เรื่อง "เมื่อ GC มีพีคประหลาด (การทำวิทยานิพนธ์ภาคปฏิบัติ ตอนที่ ๔๕)")

(ง) พีคประหลาดเกิดระหว่างการทำ calibration curve ที่เกิดจากการเจือจางสารด้วยน้ำกลั่น คือเอาสารบริสุทธิ์มาฉีดจะเห็นพีคเดียว แต่พอเจือจางในน้ำกลับเห็นมีหลายพีค ในกรณีนี้พอตรวจสอบกลับไปที่น้ำกลั่นพบว่าน้ำกลั่นที่นำมาเจือจางนั้นมีการปนเปื้อน (ดู Memoir ปีที่ ๕ ฉบับที่ ๕๙๗ วันพุธที่ ๒๗ มีนาคม ๒๕๕๖ เรื่อง "เมื่อ GC มีพีคประหลาด (การทำวิทยานิพนธ์ภาคปฏิบัติ ตอนที่ ๔๕)")

ในกรณีที่เขาถามมานี้ ผมคงให้ความเห็นได้แค่ว่า อาจลองตรวจสอบดูว่า

(๑) ถ้าสงสัยว่าเป็นที่ septum ก็อาจตรวจสอบเบื้องต้นก่อนโดยลดอุณหภูมิของ injector port ให้ต่ำกว่าอุณหภูมิ "สูงสุด" ที่ septum ทนได้ เพราะถ้าตอนแรกตั้งอุณหภูมิไว้สูงมากเกินไป แม้ว่าลดอุณหภูมิลงมาแล้วแต่ก็ยังสูงกว่าอุณหภูมิสูงสุดที่ septum ทนได้ ก็อาจยังมีปัญหาอีก ถ้าเป็นกรณีนี้เมื่อลดอุณหภูมิให้ต่ำลงมากพอ ปัญหาก็จะหายไป

(๒) ตำแหน่งที่มันปรากฏนั้น เป็นตำแหน่งซ้ำเดิม ๆ หรือไม่ เช่นถ้ามีปรากฏที่อุณหภูมิ/เวลาใดก็จะเกิดที่อุณหภูมิ/เวลานี้ตลอด ลักษณะเช่นนี้ทำให้สงสัยว่าพีคนั้นมันเข้ามาพร้อมกับตัวอย่างที่ฉีดเข้ามา

(๓) ทำการวิเคราะห์ปรกติ โดย "ไม่ต้องฉีด" สารตัวอย่าง แล้วดูว่ามีพีคดังกล่าวหรือไม่ ถ้าไม่มีแสดงว่าปัญหาอยู่ที่สารตัวอย่าง แต่ถ้ายังมีอยู่ก็แสดงว่าปัญหาไม่ได้อยู่ที่ตัวอย่าง แต่น่าจะเป็นสิ่งที่มากับ carrier gas ของเครื่อง

อีกรายถามมาเมื่อวันอังคารที่ ๓๑ กรกฎาคม ถามมาสั้น ๆ แค่สองบรรทัดแค่นี้ครับ

1. พีคที่เคยรัน conditionเดิม แต่อยู่ พีคที่เคยsharp ก้อ board นี่เปนเพราะอะไรคะ

2. รันอยู่ดีมาทั้งวัน พอตกเย็น พีคฝั่งtcd หายไปเรียบสนิทเลยค่ะ

ในกรณีเช่นนี้เนื่องจากให้ข้อมูลมาน้อยมาก ยากที่จะระบุสาเหตุที่เป็นไปได้ จึงพอจะให้คำแนะนำได้แค่ (จากประสบการณ์ที่เคยเจอ)

1. ปรกติถ้าที่โปรแกรมอุณหภูมิคอลัมน์เหมือนเดิม

1.1 ความเร็วในการออกมาของพีคจะขึ้นอยู่กับอัตราการไหลของ carrier gas ถ้า carrier gas ไหลเร็วพีคก็จะออกมาเร็ว ถ้า carrier gas ไหลช้าพีคก็จะออกมาช้า

1.2 พีคที่ออกมาเร็วมักจะคมกว่าพีคที่ออกมาช้า (พีคที่ออกมาช้าจะมีสัดส่วนความสูงต่อความกว้างที่ต่ำกว่า)

1.3 ในกรณีนี้พีคที่ออกมา broad มากขึ้นนั้นต้องไปดูด้วยว่าออกมาช้าลงกว่าเดิมหรือเปล่า (มันควรจะเป็นเช่นนั้น) ถ้าเป็นเช่นนี้แสดงว่า carrier gas flow rate ที่ไหลผ่าน column นั้นลดลง

1.4 การที่ carrier gas flow rate ไหลผ่าน column นั้นลดลงมีได้หลายสาเหตุ เท่าที่เคยเจอก็มี (สมมุติว่าไม่มีใครไปยุ่งกับ carrier gas จากถังที่ป้อนเข้า GC)

(ก) มีการรั่วที่บริเวณ septum ในกรณีนี้จะเห็นพีคออกมาช้าลง และพื้นที่น้อยลง แม้ว่าจะฉีดตัวอย่างเท่าเดิม เพราะสารตัวอย่างรั่วออกไปกับแก๊สที่รั่วออกทาง septum ทำให้ปริมาณที่เข้าคอลัมน์ลดลง ถ้าเป็นกรณีที่ septum ผ่านการใช้งานมานาน อาการดังกล่าวหนักขึ้นเรื่อย ๆ เพราะยิ่งแทง syringe ผ่าน septum ก็จะทำให้ septum รั่วมากขึ้น ถ้าเปลี่ยน septum อาการก็จะหายไป (ดู Memoir ปีที่ ๓ ฉบับที่ ๒๖๕ วันอังคารที่ ๑ มีนาคม ๒๕๕๔ เรื่อง "การทำวิทยานิพนธ์ภาคปฏิบัติ ตอนที่ ๑๕ เมื่อพีค GC ออกมาผิดเวลา") แต่ก็มีเหมือนกันว่า septum ปรกติดี แต่ขันนอตที่ใช้ยึด septum ไม่แน่น พอขันให้แน่นก็จะกลับมาเป็นปรกติ

(ข) packed column มีการอัดตัวกันแน่นมากกว่าเดิม ในกรณีนี้จะเห็นพีคออกมาช้าลง แต่พื้นที่พีคไม่ได้หายไป เพราะสารตัวอย่างที่ฉีดเข้าไปไม่ได้เกิดการรั่วไหล (ดู Memoir ปีที่ ๕ ฉบับที่ ๖๓๔ วันพุธที่ ๑๙ มิถุนายน ๒๕๕๖ เรื่อง "การแก้ปัญหา packing ในคอลัมน์ GC อัดตัวแน่น (การทำวิทยานิพนธ์ภาคปฏิบัติ ตอนที่ ๔๗)")

(ค) มีการรั่วตรงข้อต่อของ column กับ injector port ปัญหานี้เคยเจอกับกรณีของการต่อคอลัมน์แก้ว เพราะไม่สามารถขันให้แน่นได้เหมือนคอลัมน์โลหะ ถ้าเป็นกรณีนี้จะเห็นพีคออกมาช้าลงและมีขนาดเล็กลง แต่ถ้าเป็นการรั่วตรงข้อต่อระหว่าง column กับ detector port จะเห็นพีคออกมาที่เวลาคงเดิมแต่มีขนาดเล็กลง (ดู Memoir ปีที่ ๓ ฉบับที่ ๓๑๗ วันพุธที่ ๑๕ มิถุนายน ๒๕๕๔ เรื่อง "การทำวิทยานิพนธ์ภาคปฏิบัติ ตอนที่ ๒๑ เมื่อความแรงของพีค GC ลดลง")

2. ข้อนี้ตอบยาก เพราะสาเหตุที่พีคหายไปมีได้หลายแบบ ตั้งแต่ detector มีปัญหาจนถึงตัวอย่างที่ฉีดเข้าไปนั้นไม่มีสารที่ต้องการวัด มันก็เลยไม่มีพีคขึ้น นอกจากนี้ยังเคยมีกรณีของ base line ที่มีการ drift โดยเคลื่อนตัวต่ำลงไปเรื่อย ๆ จนทำให้ตกสเกลการวัด ในกรณีหลังนี้เคยเจอกับกรณีที่ใช้ integrator บันทึกผล คือ base line ของเครื่องนั้นลดต่ำลงจนทำให้พีคจมหายไป (ดู Memoir ปีที่ ๒ ฉบับที่ ๘๑ ศุกร์ ๒๗ มิถุนายน ๒๕๕๒ เรื่อง "ทำความรู้จักกับ Chromatogram (ตอนที่ 3)" กับ Memoir ปีที่ ๓ ฉบับที่ ๑๘๖ อาทิตย์ ๒๕ กรกฎาคม ๒๕๕๓ เรื่อง "ทำความรู้จักกับ Chromatogram (ตอนที่ ๔)")

ส่วนสาเหตุที่แท้จริงของปัญหาต่าง ๆ นั้นคืออะไร ผมก็ไม่ทราบเหมือนกัน เพราะไม่มีการแจ้งกลับมา