หมายเหตุ : แม้ว่าเรื่องนี้จะเขียนโดยใช้โครมาโทแกรมของ GC เป็นตัวอย่าง แต่ก็สามารถนำความรู้นี้ไปใช้กับโครมาโทแกรมของ HPLC ได้เช่นเดียวกัน
อันที่จริงผมก็ได้เตรียมเขียนเรื่องนี้เอาไว้สักเดือนแล้ว แต่พอสาวน้อยผมยาวจากจังหวัดชายแดนใต้ผู้มีความมั่นใจในตัวเองสูงมากว่าเป็นสาวสวย (ขอให้เป็นจริงอย่างที่คิดเหอะ) ถามมาเรื่องปัญหาการแยกพีค benzaldehyde และอะไรก็ไม่รู้อีกพีคหนึ่งที่ซ้อนทับกันอยู่ (ซึ่งผมสงสัยว่าอาจเป็น benzyl alcohol) ก็เลยถือโอกาสเอาเรื่องนี้ขึ้นมาเขียนต่อให้เสร็จสักที เพื่อที่พวกคุณจะได้หายสงสัย (เผื่อว่ามีอยู่) ว่าทำไมผมถึงบอกให้ดูรูปร่างของพีคและวิธีการที่เครื่องลากเส้น base line ก่อนที่จะอ่านตัวเลขพื้นที่ใต้พีคที่เครื่องอินทิเกรเตอร์มันคำนวณให้ และทำไมผมถึงมักกำชับให้พวกคุณบันทึกข้อมูลโครมาโทแกรมลงแผ่นดิสก์เอาไว้
ในการวิเคราะห์องค์ประกอบด้วยเครื่อง GC นั้น ผู้ใช้ต่างก็ทราบอยู่แล้วว่าเราสามารถหาปริมาณสารได้จากขนาดหรือความสูงของพื้นที่พีคที่ได้จากการวิเคราะห์ ในอดีตนั้นในสมัยที่ยังต้องใช้ recorder บันทึกสัญญาณเป็นรูปกราฟลงบนกระดาษ การวัดความสูงของพีคจะทำได้ง่ายกว่าการหาพื้นที่ใต้พีค การหาพื้นที่พีคในสมัยก่อนนั้นทำได้โดยการตัดพีคแต่ละพีคที่อยู่บนกระดาษ แล้วนำกระดาษของแต่ละพีคที่ตัดออกมานั้นไปชั่งน้ำหนัก พีคไหนมีพื้นที่มากก็จะให้น้ำหนักกระดาษที่มากกว่า
ในกรณีที่พีคเกิดการเหลื่อมทับกันนั้น (เช่นตัวอย่างในรูปที่ ๑) ต่างก็ทราบกันดีว่าพื้นที่ส่วนท้ายของพีค A นั้นและพื้นที่ส่วนต้นของพีค B นั้น อันที่จริงแล้วเป็นพื้นที่รวมระหว่างส่วนท้ายของพีค A และส่วนต้นของพีค B วิธีการที่ใช้กันมาแต่เดิม (สมัยที่ยังต้องตัดกระดาษบันทึกผล แล้วนำไปชั่งน้ำหนัก) คือการหาตำแหน่งจุดวกกลับระหว่างพีคสองพีค และลากเส้นแบ่ง (เส้นประสีแดง) ในแนวดิ่งจากตำแหน่งนั้นลงมายังเส้น base line
รูปที่ ๑ ตัวอย่างพีค GC ที่มีการเหลื่อมทับกัน และวิธีการแบ่งพีคที่ใช้กันมาตั้งแต่อดีต ซึ่งใช้วิธีหาตำแหน่งจุดวกกลับระหว่างพีคสองพีค (อยู่ที่ประมาณ 3.00) และลากเส้นแบ่งในแนวดิ่งที่ตำแหน่งนั้น
การแบ่งพีคด้วยเทคนิคดังกล่าว ถ้าแบ่งไม่ดีก็จะให้ผลการวิเคราะห์ที่มีความคลาดเคลื่อนสูงได้ แต่ปัจจุบันก็ยังเห็นมีการใช้กันอยู่ทั่วไปแม้ว่าจะมีการพัฒนาซอร์ฟแวร์บันทึกข้อมูลและประมวลผล แต่เทคนิคการประมวลผลกลับยังคงยึดติดกับวิธีการเดิม (ตัดกระดาษ) ไม่ได้พัฒนาไปตามความสามารถของคอมพิวเตอร์เทคนิคดังกล่าว
วิธีการที่เหมาะสมกว่าและให้พื้นที่พีคแต่ละพีคที่ถูกต้องกว่าคือการนำโครมาโทแกรมดังกล่าวมาทำการแยกพีค (peak deconvolution) พีคโครมาโทแกรมนั้นสามารถทำการ fitting ได้โดยใช้ฟังก์ชัน Gaussian ที่ไม่สมมาตร (ในโปรแกรม fityk เรียกฟังก์ชันดังกล่าวว่า SplitGaussian) คือฟังก์ชัน Gaussian ที่มีความกว้างของพีคด้านซ้ายและด้านขวาของจุดสูงสุดไม่เท่ากัน
อันที่จริงโครมาโทแกรมในรูปที่ ๑ ได้มาจากการรวมฟังก์ชัน Gaussian ที่ไม่สมมาตรสองฟังก์ชันเข้าด้วยกัน คือฟังก์ชันเส้นสีแดงและเส้นสีเขียวดังแสดงในรูปที่ ๒ ข้างล่าง
รูปที่ ๒ เส้นกราฟในรูปที่ ๑ นั้นได้มาจากการรวมฟังก์ชัน Gaussian ที่ไม่สมมาตรสองฟังก์ชันเข้าด้วยกัน เส้นประสีแดงคือรูปร่างของพีค A ส่วนเส้นประสีเขียวคือรูปร่างของพีค B เส้นทึบสีม่วงได้จากการรวมสัญญาณของพีค A และ B เข้าด้วยกัน
จากตัวอย่างในรูปที่ ๒ จะเห็นว่าความสูงที่แท้จริงของพีค A นั้นจะสูงเท่ากับพีคของโครมาโทแกรมที่ได้ ทั้งนี้เป็นเพราะในกรณีนี้พีค A ขึ้นถึงจุดสูงสุดก่อนที่พีค B จะปรากฏตัว ในกรณีของพีค B นั้นจะเห็นว่าความสูงที่แท้จริงของพีค B นั้นต่ำกว่าความสูงของโครมาโทแกรมอยู่เล็กน้อย ทั้งนี้เป็นเพราะในขณะที่สาร B หลุดออกมาจากคอลัมน์มากที่สุดนั้น สาร A ยังออกมาไม่หมด สัญญาณที่เห็นจึงเป็นสัญญาณรวมระหว่างส่วนท้ายของพีค A กับส่วนต้นของพีค B ดังนั้นในตัวอย่างนี้ถ้าเราหาปริมาณจากความสูงของพีคที่ปรากฏในโครมาโทแกรมโดยตรง เราจะหาปริมาณสาร A ได้ถูกต้องแต่จะได้ปริมาณสาร B ที่มากเกินจริงไปเล็กน้อย (ประมาณ 7%)
ทีนี้ถ้าเราหาปริมาณโดยคำนวณจากพื้นที่พีค การแบ่งตามรูปที่ ๑ นั้นจะได้พื้นที่พีค A ออกมา 0.975055 หน่วย และพื้นที่พีค B ออกมา 1.351319 หน่วย แต่ถ้าเราทำการแยกสัญญาณก่อนตามรูปที่ ๒ แล้วค่อยคำนวณพื้นที่ใต้พีคแต่ละพีคที่แยกออกมา จะได้พื้นที่พีค A ออกมา 1.073059 หน่วย และพื้นที่พีค B ออกมา 1.253314 หน่วย ซึ่งจะเห็นว่าเราได้พื้นที่ของพีค A ต่ำกว่าขนาดที่แท้จริงประมาณ 9.1% และได้พื้นที่ของพีค B สูงกว่าขนาดที่แท้จริงประมาณ 7.8%
ทีนี้ลองมาพิจารณาอีกกรณีหนึ่ง ซึ่งเป็นกรณีที่พีค B มีขนาดเล็กกว่าพีค A มาก เราจะมาลองดูกันว่าการแบ่งพื้นที่พีคแบบที่ใช้กันในอดีตนั้น (รูปที่ ๓) ให้ผลที่แตกต่างไปจากการนำฟังก์ชันไปแยกเป็นพีคย่อยก่อนและค่อยคำนวณพื้นที่พีคย่อยแต่ละพีค (รูปที่ ๔) อย่างไรบ้าง
รูปที่ ๓ การแบ่งพีคโดยใช้วิธีหาตำแหน่งจุดวกกลับระหว่างพีคสองพีค (อยู่ที่ประมาณ 3.10) และลากเส้นแบ่งในแนวดิ่งที่ตำแหน่งนั้น
รูปที่ ๔ เส้นกราฟในรูปที่ ๓ นั้นได้มาจากการรวมฟังก์ชัน Gaussian ที่ไม่สมมาตรสองฟังก์ชันเข้าด้วยกัน เส้นประสีแดงคือรูปร่างของพีค A (ใช้ฟังก์ชันเดียวกับของรูปที่ ๑) ส่วนเส้นประสีเขียวคือรูปร่างของพีค B (ใช้ฟังก์ชันเดียวกับของรูปที่ ๑ แต่มีความสูงเพียงแค่ 60% ของรูปที่ ๑) เส้นทึบสีม่วงได้จากการรวมสัญญาณของพีค A และ B เข้าด้วยกัน
ในกรณีหลังนี้ ความสูงที่แท้จริงของพีค A ในรูปที่ ๓ จะประมาณเท่ากับความสูงที่แท้จริงของพีค A แต่ความสูงของพีคที่สองที่ปรากฏในโครมาโทแกรมนั้นเป็นผลรวมระหว่างความสูงที่แท้จริงของพีค B และส่วนหางของพีค A ถ้าเราใช้ความสูงของพีคที่สองที่ปรากฏมาเป็นความสูงของพีค B เราจะได้ค่าความสูงของพีค B ที่สูงกว่าความเป็นจริงไปประมาณ 11.6%
ถ้าเราคำนวณพื้นที่ใต้พีคโดยใช้การแบ่งพีคแบบในรูปที่ ๓ เราจะได้พื้นที่ใต้พีค A เท่ากับ 1.006260 หน่วย ซึ่งจะต่ำกว่าพื้นที่จริง (ที่แสดงในรูปที่ ๔) อยู่ประมาณ 6.23% และจะได้พื้นที่พีค B เท่ากับ 0.818787 หน่วย ซึ่งสูงกว่าพื้นที่จริงของพีค B อยู่ประมาณ 8.9% (พื้นที่จริงของ B คือ 0.751988 หน่วย)
ตัวอย่างที่ยกมานั้นเป็นกรณีที่พีคทั้งสองมีการเหลื่อมซ้อนกันไม่มากและพีคตัวหน้าไม่มีการลากหางยาว และ base line อยู่ที่ระดับเดิมตลอดและไม่มีการเคลื่อน (drift) ของ base line ในกรณีที่พีคตัวหน้ามีการลากหางที่ยาวและพีคตัวหลังนั้นมีขนาดเล็กกว่ามาก (ดูรูปที่ ๕ และ ๖) และ/หรือมีการเคลื่อนของ base line การแบ่งพีคโดยการลากเส้นจากตำแหน่งจุดวกกลับลงมาถึง base line จะให้การคำนวณที่ผิดพลาดมากขึ้นไปอีก
รูปที่ ๕ กรณีที่พีคแรกมีการลากหางที่ยาว และพีคที่สองที่ตามหลังมามีขนาดเล็ก ถ้าทำการแบ่งพีคตามเทคนิคดั้งเดิมจะได้พื้นที่พีคสองส่วนดังรูป
รูปที่ ๖ ในความเป็นจริง โครมาโทแกรมในรูปที่ ๕ ได้มาจากผลรวมของพีคเส้นสีแดงและเส้นสีเขียว
จะเห็นว่าถ้าทำการแบ่งพีคตามวิธีในรูปที่ ๕ จะทำให้ได้ค่าพื้นที่พีคแรกต่ำกว่าพื้นที่จริงไปมาก และได้ค่าพื้นที่พีคของพีคที่สองที่สูงกว่าพื้นที่ที่แท้จริงไปมาก พื้นที่ที่แท้จริงของพีค A คือพื้นที่ใต้เส้นประสีแดงกับแกน x และพื้นที่ที่แท้จริงของพีค B คือพื้นที่ระหว่างเส้นประสีเขียวกับแกน x แต่ในบางครั้งโปรแกรมของเครื่อง GC หรือ integrator จะคำนวณว่าพื้นที่พีค B คือพื้นที่ที่อยู่ระหว่างเส้นทึบสีม่วงและเส้นประสีน้ำเงิน ซึ่งเรื่องนี้จะเอาไว้คุยกันต่อในตอนต่อไป
เรื่องการแยกพีคยังไม่จบแค่นี้ ยังมีอีกหลายเรื่องให้เล่าต่อไปอีก แต่ฉบับนี้คงพอแค่นี้ก่อน
สำหรับสมาชิกใหม่ของกลุ่มก็อย่ามัวแต่เรียนวิชาในห้องเรียนเพียงอย่างเดียว ให้มาเรียนวิชาความรู้ที่ต้องใช้ในการทำวิทยานิพนธ์ภาคปฏิบัติด้วย และถ้าอ่าน Memoir ฉบับนี้แล้วยังไม่เข้าใจ ก็ขอให้ไปอ่าน Memoir ฉบับก่อนหน้านี้ ๓ ฉบับที่เกี่ยวข้องกับการทำ peak fitting ด้วย ได้แก่
ปีที่ ๓ ฉบับที่ ๒๖๐ วันพุธที่ ๑๖ กุมภาพันธ์ ๒๕๕๔ เรื่อง "Distribution functions"
ปีที่ ๓ ฉบับที่ ๒๖๑ วันศุกร์ ๑๘ กุมภาพันธ์ ๒๕๕๔ เรื่อง "XRD - peak fitting"
ปีที่ ๓ ฉบับที่ ๒๖๓ วันอังคาร ๒๒ กุมภาพันธ์ ๒๕๕๔ เรื่อง "UV-Vis - peak fitting"
ไฟล์ฉบับ pdf สามารถไปคัดสำเนาได้จากเครื่องคอมพิวเตอร์ส่วนกลางของกลุ่ม ผมเอาลงไว้ที่นั่นแล้ว ซึ่งเมื่อคุณได้อ่าน ๓ ฉบับที่ผมกล่าวไว้ข้างต้นก็คิดว่าคงจะยังไม่เข้าใจอยู่ดี แต่ก็น่าจะเห็นแล้วว่าในการทำงานภาคปฏิบัติเพื่อให้ได้ผลการทดลองที่ออกมาถูกต้องนั้น มันมีปัญหาอะไรบ้าง
ไม่มีความคิดเห็น:
แสดงความคิดเห็น