Relative Response Factors (RRF) ของสารอินทรีย์ กับ Flame Ionisation Detector (FID) MO Memoir : Monday 13 March 2560

ในการวิเคราะห์ด้วยเทคนิคโครมาโทกราฟนั้น นิยามของค่า Response Factor (RF) คืออัตราส่วนระหว่างพื้นที่พีคต่อความเข้มข้น ส่วนค่า Relative Response Factor (RRF) คือค่า RF ของสาร A ต่อค่า RF ของสาร B
 

มองอีกมุมหนึ่งคือ ถ้าเราฉีดสาร A ใน "ปริมาณ" หนึ่ง ทำให้ตัวตรวจวัด (detector) ส่งสัญญาณออกมาเป็นพีคที่มีพื้นที่ใต้พีค Area (A) แล้วถ้าเราฉีดสาร B ในปริมาณที่ "เท่ากับ" สาร A ที่ฉีดเข้าไป ทำให้ตัวตรวจวัดส่งสัญญาณออกมาเป็นพีคที่มีพื้นที่ใต้พีค Area (ฺB) คำถามก็คือ Area (A) ควรเท่ากับ Area (B) หรือไม่
 

ตรงนี้ก็ต้องกลับไปดูก่อนว่าเราใช้หน่วยอะไรวัด "ปริมาณ" (โมล น้ำหนัก จำนวนอะตอมของธาตุบางธาตุ ฯลฯ) เพื่อใช้เปรียบเทียบว่ามีการฉีดเข้าไปเท่ากัน
 

ในกรณีของ Flame Ionisation Detector (FID) ที่ใช้หลักการเผาสารอินทรีย์ให้ลุกไหม้ และตรวจวัดปริมาณอนุมูลมีประจุที่เกิดขึ้นระหว่างการเผาไหม้นั้น ปริมาณอนุมูลมีประจุที่เกิดขึ้นขึ้นอยู่กับจำนวนอะตอม C และ O เป็นหลัก ในกรณีของสารประกอบไฮโดรคาร์บอนที่ประกอบด้วยอะตอม C และ H เท่านั้น พบว่าถ้าเปรียบเทียบโดยใช้เกณฑ์จำนวนอะตอม C ที่ฉีดเข้าไปเท่ากัน พื้นที่ใต้พีคของแต่ละสารที่ได้จะประมาณได้ว่าเท่ากัน ตัวอย่างเช่นจากข้อมูลในตารางที่ ๑ ของเอกสารที่แนบมา สมมุติว่าเราฉีด heptane (C₇H₁₆) 0.01 mmol แล้วได้พื้นที่พีคออกมา 1000000 หน่วย ดังนั้นถ้าเราฉีด methane (CH₄) เข้าไป 0.07 mmol (จำนวนอะตอม C ที่ฉีดเข้าไปเท่ากัน) เราก็ควรจะได้พื้นที่พีคออกมาประมาณ 1000000 หน่วยด้วย หรือถ้าเราฉีด dimethylpentane (C₅H₁₀(CH₃)₂) เข้าไป 0.01 mmol (โมเลกุลต่างกัน แต่จะนวนอะตอม C เท่ากัน) เราก็ควรจะได้พื้นที่พีคออกมาประมาณ 1000000 หน่วยเช่นกัน
 

ในกรณีของสารประกอบไฮโดรคาร์บอน ข้อมูลที่มีผู้ทำการทดลองไว้ที่แสดงในตารางที่ ๑ ของเอกสารที่แนบมาบ่งบอกว่าค่า RRF ของไฮโดรคาร์บอนนั้นมีค่าประมาณ 1 จะมียกเว้นบางคือ benzene (C₆H₆) ที่ให้ค่า RRF เป็น 1.12 และ toluene (C₆H₅CH₃) และ acetylene (C₂H₂) ที่ให้ค่า RRF เป็น 1.07 (เบี่ยงเบนไปเกิน 5%) กล่าวคือสมมุติถ้าว่าเราฉีด heptane (C₇H₁₆) 0.01 mmol แล้วได้พื้นที่พีคออกมา 1000000 หน่วย แต่พอเอา toluene จำนวน 0.01 mol (อะตอม C เท่ากัน) มาฉีด เราจะได้พื้นที่พีคออกมา 1070000 หน่วย
 

ในกรณีของสารประกอบที่มีอะตอม O เป็นองค์ประกอบนั้น เมื่อเทียบกับไฮโดรคาร์บอนที่มีจำนวนอะตอม C เท่ากันพบว่า ยิ่งสัดส่วนจำนวน O ในโมเลกุลเพิ่มขึ้นมากเท่าใด ค่า RRF ของสารจะยิ่งลดลงมากเท่านั้น อย่างเช่นในกรณีของ methane (CH₄) methanol (CH₃OH) และ formic acid (HCOOH) ที่มีค่า RRF เป็น 1.00 0.23 และ 0.01 ตามลำดับ
 

การที่สารประกอบไฮโดรคาร์บอนให้ค่า RRF ประมาณ 1 (หรือคลาดเคลื่อนไปไม่เกิน 5%) นั้นมันทำให้ง่ายในการวิเคราะห์ตรงที่เราสามารถใช้พื้นที่พีคเป็นตัวเปรียบเทียบจำนวนอะตอม C ของแต่ละพีคได้ ส่วนจะเป็นสารใดในจำนวนโมลเท่าใดนั้นก็ต้องเอาจำนวนอะตอม C ในโมเลกุลสารนั้นไปปรับค่าอีกที ตรงนี้มันทำให้ง่ายในการสร้าง calibration curve ของสารประกอบไฮโดรคาร์บอน คือทำให้เราไม่จำเป็นต้องสร้าง calibration curve สำหรับทุกสาร สร้างเพียงแค่ของสารใดสารหนึ่งพอ แล้วใช้ค่า RRF เป็นตัวปรับ เช่นเราอาจสร้าง calibration curve ของ ethane (C₂H₆ RRF = 0.97) ขึ้นมา ถ้าเราจะเอา curve นี้ไปใช้กับ ethylene (C₂H₄ RRF = 1.02) เราก็ต้องพื้นที่ calibration curve ของ ethane มาคูณด้วย 1.02/0.97 หรือ 1.05 ก่อน ก็จะได้ calibration curve สำหรับ ethylene (กล่าวอีกนัยหนึ่งคือที่จำนวนโมลที่ฉีดเท่ากัน ethylene จะให้สัญญาณที่แรงกว่า ethane อยู่ 5%)
 

RRF มันบอกว่าถ้าเราเอาสารใดสารหนึ่งฉีดเข้า GC ในปริมาณหนึ่ง และถ้าเราเอาสารอีกชนิดหนึ่งมาฉีดเข้า GC ในปริมาณที่เท่ากัน (อย่างเช่นในกรณีของไฮโดรคาร์บอนคืออะตอม C เท่ากัน) พื้นที่พีคที่วัดได้ของทั้งสองสารนั้นจะออกมาประมาณเท่ากันแค่นั้นเอง
 

RRF มัน "ไม่ได้" บอกว่าถ้าเราเอาสารใดสารหนึ่งปริมาณ 1 หน่วยฉีดเข้า GC แล้วได้พื้นที่พีคออกมาในปริมาณหนึ่ง และถ้าเราเอาสารเดิมนั้นมาเพียงแค่ 0.001 หน่วย (หรือ 1 ใน 1000) มาฉีดเข้า GC เราจะต้องได้พื้นที่พีคออกมาเพียงแค่ 1 ใน 1000 ของพื้นที่พีคที่ได้จากการฉีดสารนั้นเข้าไป 1 หน่วย เพราะตรงนี้มันขึ้นอยู่กับ "linearity" ของตัวตรวจวัด ว่าความสัมพันธ์ระหว่างปริมาณสารกับพื้นที่พีคที่ได้นั้น มีความสัมพันธ์ที่ประมาณได้ว่าเป็นเส้นตรงนั้น เป็นช่วงกว้างเท่าใด
 

จริงอยู่ที่ว่า FID นั้นมีการตอบสนองที่มี linearity ในช่วงกว้าง แต่จากประสบการณ์ส่วนตัวพบว่าเวลาทำงานกับสารอินทรีย์ที่ต้องทำการวิเคราะห์ในช่วงความเข้มข้นที่กว้างเมื่อใด จำเป็นต้องตรวจสอบ linearity ของ FID ทั้งในช่วงความเข้มข้นสูงและความเข้มข้นต่ำเสมอ และมักจะพบว่าถ้าได้ calibration curve ที่เป็นเส้นตรงสองเส้นที่มีค่าความชันแตกต่างกันนั้นก็ไม่ใช่เรื่องผิดปรกติเหนือความคาดหมาย ที่เคยเจอนั้น ที่ความเข้มข้นต่ำจะให้ค่าความชันที่สูงกว่าอยู่เรื่อยโดยเส้นตรงดังกล่าวจะมุ่งเข้าหาจุดตัดแกน ในขณะที่ช่วงความเข้มข้นสูงนั้นแม้ว่าจะประมาณว่าเป็นเส้นตรงได้ดี แต่เมื่อต่อเส้นตรงนั้นออกไปมักจะพบว่าจะไปตัดแกน y ที่ตำแหน่งเหนือจุดตัดแกนเป็นประจำ (ตอนทำ regression ต้องไม่นำเอาจุด (0,0) มาใช้คำนวณนะ) เรื่องการสร้าง calibration curve นี้ดูเพิ่มเติมได้ใน Memoir ปีที่ ๑ ฉบับที่ ๒๑ วันอังคารที่ ๙ ธันวาคม ๒๕๕๑ เรื่อง "ลากให้ผ่านหรือไม่ให้ผ่าน"
 

การที่ไม่ตรวจสอบ linearity ของตัว FID ว่ามันครอบคลุมช่วงที่ทำการวิเคราะห์หรือไม่นั้นอาจก่อให้เกิดปัญหาในการแปลผลได้ อย่างเช่นสมมุติว่าเราทำปฏิกิริยา catalytic cracking ของไฮโดรคาร์บอนตัวหนึ่ง เรานำสารตั้งต้นมาฉีดเข้า GC แล้วได้พื้นที่พีคออกมา 1000000 หน่วย (มีพีคปรากฏเพียงพีคเดียว) และเมื่อเรานำผลิตภัณฑ์มาฉีดเข้า GC พบว่ามีพีคปรากฏออกมาหลายพีค (ทั้งของสารตั้งต้นที่ยังไม่ทำปฏิกิริยา และผลิตภัณฑ์ต่าง ๆ ที่เกิดขึ้น) และเมื่อนำพื้นที่ของแต่ละพีคมาบวกรวมเข้าด้วยกันพบว่าเท่ากับพื้นที่พีคของสารตั้งต้นที่ฉีดเข้าไป (คือ 1000000 หน่วย) คำถามก็คือเราจะถือได้เลยไหมว่า จำนวนอะตอมคาร์บอนที่ออกมากับสายผลิตภัณฑ์นั้นเท่ากับจำนวนอะตอมคาร์บอนที่ป้อนเข้าไป หรือกล่าวอีกนัยหนึ่งคือไม่มีสารตกค้างอยู่ในระบบ (เช่นเกิดเป็น coke ที่เป็นของแข็งเกาะสะสมอยู่ภายในระบบ)
 

สมมุติว่าในการวัดดังกล่าว พีคที่มีขนาดเล็กที่สุดมีพื้นที่ 10000 หน่วยหรือ 1 ใน 100 ของสารตั้งต้นที่ป้อนเข้าระบบ เราก็ควรทดลองฉีดสารตั้งต้นในปริมาณ 1 ใน 100 ของที่ใช้ในการทดลอง เพื่อที่จะดูว่าพีคที่ได้นั้นมีพื้นที่ลดลงเหลือเพียง 1 ใน 100 ของ 1000000 หน่วย (หรือ 10000 หน่วย) หรือไม่ ถ้าพบว่าเมื่อฉีดสารน้อยลงเหลือ 1 ใน 100 ส่วนแล้วได้พื้นที่พีคลงลงเหลือ 1 ใน 100 ส่วนด้วย นั่นก็แสดงว่าความสัมพันธ์ระหว่างปริมาณกับความแรงของสัญญาณที่วัดได้นั้นยังคงประมาณได้ว่าเป็นเส้นตรงอยู่ (ค่า Response Factor หรือ RF คงที่) สัดส่วนของสารแต่ละตัวในสายผลิตภัณฑ์จะเทียบเท่ากับสัดส่วนพื้นที่พีคของสารนั้นเทียบกับพื้นที่พีคของสารตั้งต้นในสายป้อน แต่ถ้าพบว่าเมื่อฉีดสารเข้าไป 1 ใน 100 ส่วนกลับได้พื้นที่ออกมา 12000 หน่วย นั่นแสดงว่าที่ความเข้มข้นต่ำ ๆ นั้นค่า RF (พื้นที่ต่อความเข้มข้น) เพิ่มสูงขึ้น ดังนั้นการเอาพื้นที่พีคด้านขาออกมาบวกรวมเข้าด้วยกันโดยตรง โดยอิงจากค่า RF ที่ความเข้มข้นสูง จะทำให้ได้ปริมาณผลิตภัณฑ์ขาออกที่สูงเกินจริง

สำหรับวันนี้ ก็คงจะขอจบเพียงแค่นี้