วันอาทิตย์ที่ 25 กรกฎาคม พ.ศ. 2553

ทำความรู้จักกับ Chromatogram (ตอนที่ ๔) MO Memoir : Sunday 25 July 2553

บันทึกที่เกี่ยวข้องโดยตรงกับบันทึกฉบับนี้มีอยู่ ๔ ฉบับคือ

ปีที่ ๒ ฉบับที่ ๔๓ วันศุกร์ที่ ๑๐ กรกฎาคม ๒๕๕๒ เรื่อง ทำความรู้จักกับ Chromatogram (ตอนที่ ๒)

ปีที่ ๒ ฉบับที่ ๘๑ วันศุกร์ที่ ๒๗ พฤศจิกายน ๒๕๕๒ เรื่อง ทำความรู้จักกับ Chromatogram (ตอนที่ ๓)

ปีที่ ๓ ฉบับที่ ๑๘๓ วันพุธที่ ๑๔ กรกฎาคม ๒๕๕๓ เรื่อง การบันทึกโครมาโทแกรมลงแผ่นดิสก์

ปีที่ ๓ ฉบับที่ ๑๘๕ วันพฤหัสบดีที่ ๒๒ กรกฎาคม ๒๕๕๓ เรื่อง แนวทางหัวข้อการทำวิทยานิพนธ์นิสิตรหัส ๕๒ (ตอนที่ ๔)


จากประสบการณ์ที่ผ่านมานั้น การแก้ปัญหาผลการวิเคราะห์ที่ดูเหมือนว่าผิดพลาดนั้น จะต้องลงไปเฝ้าสังเกตเหตุการณ์ต่าง ๆ ที่เกิดขึ้นนับตั้งแต่เวลาที่เราเริ่มต้นทำการวิเคราะห์ ไม่ใช่ว่าพอเริ่มการวิเคราะห์แล้วก็เดินจากเครื่องไปเลย ไม่ได้อยู่เฝ้าสังเกตว่าในระหว่างการวิเคราะห์มีเหตุผิดปรกติใด ๆ หรือเปล่า เพียงเพราะเห็นว่ามีคอมพิวเตอร์ควบคุมแล้วก็เลยไม่ใส่ใจ กลับมาอีกทีก็เมื่อคาดว่าการวิเคราะห์เสร็จสิ้นแล้วจะได้มาเอาผลไปเลย เหตุการณ์ทำนองนี้เคยเล่าไว้แล้วในบันทึกปีที่ ๒ ฉบับที่ ๖๗ วันพฤหัสบดีที่ ๑๕ ตุลาคม ๒๕๕๒ เรื่องเสียงอะไรดัง ซึ่งพวกคุณคนใดที่ยังไม่ได้อ่านก็ควรกลับไปอ่านดูด้วย

แต่บางทีเรื่องนี้ก็ไปโทษเขาไม่ได้ เพราะเขาไม่รู้ว่าต้องสังเกตตรงไหน อาจจะเป็นเพราะพึ่งจะเริ่มหัดใช้เครื่องมือ อาจเป็นเพราะว่าไม่มีเวลาไปอ่านคู่มือ (เพราะต้องทำโน่นทำนี่ตามแต่จะถูกใช้ให้ทำ) หรือคิดว่าการอ่านคู่มือไม่ใช่สิ่งสำคัญ (ก็เขาสอนต่อ ๆ กันมาอย่างนั้น เอาเวลาไปอ่าน paper ดีกว่า) ทำให้หลายครั้งที่พบว่าผลทดลองที่ออกมาดูดีนั้นเป็นเพราะการวิเคราะห์ที่ผิดพลาด เช่นทำให้ค่า conversion ออกมาดูสูงหรือมี by product เกิดขึ้นน้อยหรือไม่มีเลย) หรือในบางครั้งก็พบว่าผลการทดลองนั้นมีปัญหา แต่ไม่รู้ว่าจะแก้ไขอย่างไรดี (ที่ปรึกษาก็บอกแต่ว่าให้ไปคิดเอาเอง) พอแก้ไขไม่ได้ก็เลยปลอมผลการวิเคราะห์ส่งให้เลย (ที่ปรึกษาไม่รู้หรอกเพราะไม่เคยสนใจว่าคนทำแลปนั้นทำแลปจริงหรือไม่ หรือมีสภาพการทำแลปอย่างไร)


เหตุการณ์เริ่มจากการที่ให้สาวน้อยหน้าใสจากบางละมุงไปทำ calibration curve ของฟีนอลตามบันทึกฉบับที่ ๑๘๕ และให้หาเวลา (retention time) ที่ฟีนอลออกจากคอลัมน์

เช้าวันศุกร์ที่ ๒๓ ก็ได้รับทราบว่ามันมีปัญหาดังนี้คือ ตอนวันพฤหัสบดีที่ ๒๒ นั้นได้เตรียมสารละลายฟีนอลเอาไว้ และทดลองฉีดเพื่อหาเวลาที่ฟีนอลออกจากคอลัมน์ ก็พบว่ามีฟีนอลออกมา และก็ได้ทำลองทำการปรับแต่งอัตราการไหลของ carrier gas เพื่อปรับระยะเวลานั้น ซึ่งก็ทำการปรับแต่งจนได้เวลาที่ฟีนอลออกจากคอลัมน์ประมาณ ๑๒.๘ นาที แต่พอนำสารละลายขวดเดิมมาฉีดในเช้าวันรุ่งขึ้น (วันที่ ๒๓) ด้วยภาวะการทำงานของเครื่อง GC เหมือนเดิม แต่ครั้งนี้พอฉีดเข้าไปแล้วไม่ปรากฎพีคของฟีนอล

ตอนแรกก็นึกว่าปัญหาเกิดจากการที่ฟีนอลที่เตรียมไว้ในวันพฤหัสบดีมันระเหยออกไปหมด พอนำมาฉีดในวันศุกร์ก็เลยไม่เห็นอะไร (ดูคำอธิบายในบันทึกฉบับที่ ๑๘๕) ผมก็เลยบอกให้สาวน้อยหน้าใสจากบางละมุงไปเตรียมสารละลายฟีนอลใหม่ คราวนี้ให้เข้มข้นมากกว่าเดิม เพราะดูเหมือนว่าผลการทดลองของเขาจะได้ฟีนอลในปริมาณที่มากกว่าวที่รุ่นก่อนหน้าทำได้

บ่ายวันนั้นผมกลับมานั่งคิดอีกที เพราะตัวเองก็รู้สึกว่าวิธีการแก้ปัญหาที่บอกไปนั้นมันมีอะไรคาใจอยู่ กล่าวคือสารละลายที่สาวน้อยหน้าใสจากบางละมุงเตรียมขึ้นนั้นเป็นความเข้มข้นที่ไม่ได้ต่ำมาก (ประมาณ 0.01 M) เตรียมขึ้นในปริมาณมาก (100 ml) บรรจุในขวดวัดปริมาตรขนาด 100 ml และปิดฝาไว้ด้วย แม้ว่าจะมีที่ว่างระหว่างผิวหน้าสารละลายกับฝาขวด แต่ก็เป็นที่ว่างขนาดเล็กเมื่อเทียบกับปริมาตรของเหลวในขวด ดังนั้นภายในเวลาเพียงคืนเดียวหลังเตรียมขึ้น ฟีนอลที่ละลายอยู่ไม่น่าจะระเหยออกมาจนหมด ราว ๆ บ่ายสามโมงก่อนกลับก็เลยแวะไปที่แลปอีกครั้ง พบว่าเครื่อง GC กำลังทำงานอยู่โดยไม่มีใครอยู่ในห้อง คาดว่าสาวน้อยหน้าใสจากบางละมุงคงพึ่งจะฉีดสารละลายมาตรฐานแล้วเข้าไปพักผ่อนข้างใน ตอนนั้นเครื่องทำการวิเคราะห์ไปได้ ๑๐ นาที่แล้ว ผมเห็นว่าใกล้เวลาที่ฟีนอลจะออกมาจากคอลัมน์ (ที่เวลาประมาณ ๑๒.๘ นาที) ก็เลยยืนรอดูสัญญาณว่ามีฟีนอลออกมาหรือไม่

สิ่งที่ผมยืนดูก็คือสัญญาณที่แสดงบนหน้าจอเครื่อง C-R8A (ดูรูปที่ 1 ประกอบ) หมายเลข [7] คือเวลาของการวิเคราะห์ ส่วน [8] คือสัญญาณที่ส่งมาจากเครื่อง GC

ในช่วงแรกสัญญาณที่ส่งออกมามีค่าประมาณ -360 microV แต่พอใกล้เวลาประมาณ 13 นาทีก็เห็นสัญญาณเพิ่มขึ้นจนมีค่าเป็นบวก และตกลงมาอยู่ที่ระดับประมาณ -360 microV เหมือนเดิม ซึ่งเป็นลักษณะของการเกิดพีค

รูปที่ 1 ตัวอย่างหน้าจอเครื่อง C-R8A ในระหว่างการวิเคราะห์ (ภาพจากคู่มือของเครื่อง) [7] คือเวลาเริ่มตั้งแต่กดปุ่ม start (หรือ retention time) ส่วน [8] คือสัญญาณที่รับมาจากเครื่อง GC [10] คือชื่อไฟล์ที่เครื่องบันทึกข้อมูลเอาไว้

ปรากฏ ว่าเมื่อถึงเวลาดังกล่าวก็เห็นสัญญาณว่ามีฟีนอลออกมาจากคอลัมน์จริง แต่ไม่มีพีคปรากฏบนกราฟโครมาโทแกรม ผมก็เลยไปตามสาวน้อยหน้าใสจากบางละมุงให้มาดูและหยุดบันทึกผล ซึ่งเมื่อกดปุ่มหยุดการบันทึกผลบนเครื่อง C-R8A เครื่องกลับรายงานว่าตรวจไม่พบพีคใด ๆ โครมาโทแกรมที่ได้มานั้นแสดงไว้ในรูปที่ 2 แล้ว


รูปที่ 2 โครมาโทแกรมที่ได้มาจากเครื่องอินทิเกรเตอร์ C-R8A จะเห็นว่ากราฟไม่มีสัญญาณพีคใด ๆ และเครื่องก็รายงานว่าตรวจไม่พบพีคใด ๆ


ผมก็เลยบอกให้เขาแปลงไฟล์ที่เครื่อง C-R8A บันทึกไว้ และบันทึกข้อมูลที่แปลงแล้วลงแผ่นดิสก์ (ตามวิธีการในบันทึกฉบับที่ ๑๘๓) จากนั้นก็นำมาเปิดดูด้วยโปรแกรม spreadsheet ก็ได้กราฟดังแสดงไว้ในรูปที่ 3 ซึ่งก็พบว่ามีพีคที่เวลาประมาณ 13 นาทีดังที่ผมสังเกตเห็น และที่เวลาประมาณ 3-4 นาทีก็มีพีคเล็ก ๆ ด้วยพีคหนึ่ง (คงเป็นพีคของสิ่งปนเปื้อน)

รูปที่ 3 แต่เมื่อนำข้อมูลที่เครื่องอินทิเกรเตอร์ C-R8A บันทึกไว้มาตรวจสอบ พบว่ามีพีคฟีนอลที่เวลาประมาณ 13 นาที แต่เส้น base line และส่วนใหญ่ของตัวพีคนั้นอยู่ใต้แกน x มาก (เส้นสัญญาณเป็น 0)


จากนั้นผมก็บอกให้สาวน้อยหน้าใสจากบางละมุงทำการปรับสัญญาณที่ส่งมาจากเครื่อง GC โดยให้หมุนปุ่มปรับ zero ที่เครื่อง GC เพื่อให้สัญญาณที่เครื่องอินทิเกรเตอร์ C-R8A อ่านได้นั้นมีค่าเป็นบวก โดยให้ลองตั้งเอาไว้ก่อนที่ประมาณ 100 microV

สาเหตุที่ตั้งสัญญาณเริ่มต้นให้มากกว่า 0 microV ก็เพื่อไว้ตรวจสอบดูว่าเมื่อทำการวิเคราะห์ไปเรื่อย ๆ นั้น เส้น base line มีการเลื่อนระดับต่ำลงไปเรื่อย ๆ หรือไม่

(กรณีที่เส้น base line มันเลื่อนขึ้นไม่ค่อยมีปัญหาในการตรวจพบ เพราะมันมองเห็นได้ชัด แต่กรณีที่เส้น base line มันเลื่อนลงมันจะมองยากกว่า เพราะถ้าเส้นกราฟมันติดขอบกระดาษแล้วมันจะกลายเป็นเส้นตรงขนานไปกับขอบกระดาษ ทำให้ดูเหมือนเส้น base line มันนิ่ง ประสบการณ์ที่ผ่านมามันสอนให้รู้ว่าสัญญาณบางอย่างนั้นถ้ามันดูราบเรียบเกินไปมันไม่น่าจะไว้ใจสักเท่าใดนัก)

จากนั้นก็ให้ทดลองฉีดสารละลายฟีนอลเข้าไปใหม่ ซึ่งคราวนี้ปรากฎพีคฟีนอลที่ตำแหน่งเวลาประมาณ 12.8 นาทีดังแสดงในรูปที่ 4


รูปที่ 4 หลังจากปรับแก้ตำแหน่งของเส้น base line แล้ว จะเห็นว่าได้พีคฟีนอลกลับมาที่เวลา 12.874 นาที

กรณี นี้เป็นเหตุการณ์ทำนองเดียวกับที่เคยเล่าไว้ในบันทึกฉบับที่ ๘๑ ในกรณีนั้นเป็นเพียงพีคเล็ก ๆ ที่หายไป แต่ในเหตุการณ์ครั้งนี้กลายเป็นพีคที่มีขนาดใหญ่หายไป (พื้นที่ขนาดกว่าสองล้าน)

เหตุการณ์ ตามบันทึกฉบับนี้ เราเสียเวลากันจนหมดไปหนึ่งวันกว่าจะหาสาเหตุเจอ แม้แต่ตัวผมเองแม้จะเคยเจอมาแล้ว เคยเขียนบันทึกเรื่องราวดังกล่าวเอาไว้แล้ว (ฉบับที่ ๘๑) แต่ พอเจอเหตุการณ์ที่คล้ายของเดิมก็ยังหลงทางไปเหมือนกัน ต้องใช้เวลาทบทวนอยู่พักนึง ทำให้ต้องเขียนเรื่องนี้ขึ้นมาใหม่แม้ว่ามันจะคล้ายกับเรื่องที่เกิดไปแล้ว เพื่อเป็นการเตือนเรื่องราวที่เกิดซ้ำซากได้เสมอ

ไม่มีความคิดเห็น: