ทำความรู้จักกับ Chromatogram ตอนที่ ๖ MO Memoir : Saturday 17 January 2558

เมื่อวันพฤหัสบดีที่ ๑๕ ที่ผ่านมา ทางกลุ่มได้มีการฝึกการใช้เครื่องแก๊สโครมาโทกราฟ (Gas Chromatograph - GC)ให้กับสมาชิกปี ๑ (นิสิตป.โท จำนวน ๕ ราย) เครื่องที่ใช้คือ Shimadzu GC-8A ติดตั้งตัวตรวจวัดชนิด Flame Ionisation Detector (FID) และบันทึกผลด้วยเครื่องอินทิเกรเตอร์ Shimadzu CR-8A โดยให้ทดลองวัดปริมาณความเข้มข้นอิ่มตัวของโทลูอีน (Toluene C₆H₅-CH₃) ที่ละลายในน้ำ ในช่วงเช้าเริ่มจากการนำโทลูอีนบริสุทธิ์มาฉีดเพื่อหาตำแหน่งพีค (เวลาที่โทลูอีนออกมาจากคอลัมน์) จากนั้นก็ปล่อยให้ทดลองหาภาวะที่เหมาะสมในการตั้งเครื่อง GC และอินทิเกรเตอร์ (พวก Range, Attenuation) เพื่อให้ได้รูปพีคโทลูอีนที่มีขนาดที่เหมาะสมบนกระดาษ และสัญญาณจาก FID ไม่เกิดการอิ่มตัว จากนั้นในช่วงบ่ายก็เป็นการฝึกฝีมือในการฉีดตัวอย่างของสมาชิกกลุ่มแต่ละคน เพื่อทดสอบว่าด้วยการใช้อุปกรณ์ตัวเดียวกัน ตัวอย่างตัวเดียวกัน ผลการวิเคราะห์ที่ได้นั้นจะออกมาอย่างไร
 

ในตอนแรกก็พบว่าฝีมือการฉีดแต่ละรายนั้นเอาแน่เอานอนไม่ได้ (เรื่องปรกติของมือใหม่) ไม่ว่าคนเดิมจะทำการฉีดซ้ำหรือเปรียบเทียบผลการวัดระหว่างแต่ละคน แต่บ่ายวันนั้นมันก็มีอะไรที่น่าสนใจหลายอย่าง ตัวอย่างเช่นผลการทดลองฉีดตัวอย่าง ๓ ครั้งที่เอามาให้ดูในรูปที่ ๑ ในหน้าถัดไป พีคที่เวลา 2.2-2.3 นาทีคือพีคของโทลูอีน ส่วนพีคเล็ก ๆ ก่อนหน้าหน้า (ที่เวลาประมาณ 1.2-1.3 นาที) นั้นค่อยว่ากันต่อในฉบับหน้า (มันมีเรื่องของพีคนี้โดยเฉพาะว่ามันมาจากไหน) ตรงนี้อยากให้สังเกตตรงค่าพื้นที่พีคและความสูงที่เครื่องอินทิเกรเตอร์วัดได้ดังนี้

ครั้งที่ ๑ พื้นที่พีค 795880 ความสูง 18323

ครั้งที่ ๒ พื้นที่พีค 938411 ความสูง 18186

ครั้งที่ ๓ พื้นที่พีค 734722 ความสูง 18928

ปรกตินั้นเราชอบที่จะใช้พื้นที่พีคมากกว่าที่จะใช้ความสูงของพีคในการบ่งบอกปริมาณสาร เพราะถ้า carrier gas ไหลไม่นิ่ง จะทำให้รูปความสูงของพีคนั้นเปลี่ยนไปตามอัตราการไหลของ carrier gas กล่าวคือถ้าไหลเร็วก็จะได้พีคแคบและสูง ถ้าไหลช้าก็จะได้พีคที่เตี้ยและกว้าง แต่พื้นที่จะประมาณเดิม 
   

ในกรณีของตัวอย่างที่ยกมานั้น จะเห็นว่าพื้นที่ของการฉีดครั้งที่ ๒ นั้นมากกว่าพื้นที่ของการฉีดครั้งที่ ๓ อยู่ 1.28 เท่า (938411/734722) และพื้นที่ของการฉีดครั้งที่ ๑ นั้นมากกว่าพื้นที่ของการฉีดครั้งที่ ๓ อยู่ 1.08 เท่า (795882/734722) ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการฉีดครั้งที่ ๑ และ ๓ นั้นให้ผลที่ใกล้เคียงกัน แต่ถ้าพิจารณาความสูงแล้วจะพบว่าการฉีดครั้งที่ ๒ ที่ให้พื้นที่มากที่สุดนั้นกลับให้ค่าความสูงพีคที่น้อยที่สุด 
   

แต่ถ้าพิจารณาจากความสูงจะพบว่าความสูงของพีคของการฉีดครั้งที่ ๓ มากกว่าของการฉีดครั้งที่ ๒ อยู่ 1.04 เท่า (18928/18186) และความสูงของพีคของการฉีดครั้งที่ ๑ มากกว่าของการฉีดครั้งที่ ๒ อยู่ 1.01 เท่า (18323/18186) ซึ่งจะเห็นว่าพีคความสูงของการฉีดทั้ง ๓ ครั้งใกล้เคียงกันมาก และถ้าพิจารณาจากรูปร่างของพีคที่ได้แล้วจะเห็นว่าขนาดของพีคทั้งสามใกล้เคียงกันมาก

ด้วยเหตุนี้จึงทำให้เกิดคำถามว่าถ้าเช่นนั้นอะไรทำให้การคำนวณพื้นที่พีคของการฉีดครั้งที่ ๒ นั้นได้มากกว่าของการฉีดครั้งแรกกับครั้งที่ ๓ ถึง 20%
  

คำตอบของคำถามดังกล่าวอยู่ที่ผลที่เครื่องพิมพ์ออกมาคือช่อง MK (ย่อมากจา Marks หรือหมายเหตุ) ซึ่งจะเห็นว่าในกรณีของการฉีดครั้งที่ ๑ และ ๓ นั้นมีการพิมพ์สัญญลักษณ์ V ที่ตำแหน่งพีคประมาณ 1.25 และ 2.2-2.3 นาที ในขณะที่การฉีดครั้งที่ ๒ นั้นมีการพิมพ์สัญญลักษณ์ V ที่ตำแหน่งพีค2.2-2.3 นาทีเพียงที่เดียว
 

รูปที่ ๑ โครมาโทแกรมที่ได้มาจากการฉีดน้ำที่มีโทลูอีนละลายอยู่
    
รูปที่ ๒ และ ๓ ข้างล่างเป็นคำอธิบายความหมายของสัญญลักษณ์ที่ปรากฏในช่อง MK ผมนำมาจากคู่มือของเครื่องอินทิเกรเตอร์ Shimadzu CR-5A แต่ของเครื่อง CR-8A ก็เหมือนกัน

  

รูปที่ ๒ คำอธิบายความหมายของสัญญลักษณ์ต่าง ๆ ในช่อง MK ของรูปที่ ๑

รูปที่ ๓ สำหรับพีคที่เหลื่อมซ้อนกัน ด้วยค่า Drift ที่แตกต่างกันจะทำให้คำนวณพื้นที่พีคได้แตกต่างกันเนื่องจากมีการลาก base line ที่แตกต่างกัน

ขอให้พิจารณาวิธีการลาก base line ที่อยู่ในกรอบสีแดงของรูปที่ ๓ ในกรณีของการฉีดครั้งที ่๑ และ ๓ นั้นเครื่องอินทิเกรเตอร์ทำการลาก base line ตามแบบที่ (2) คือลากจากจุดเริ่มเกิดพีคแรกไปจนถึงจุดที่สัญญาณเกิดการวกกลับที่เป็นจุดที่เครื่องระบุว่าเป็นตำแหน่งเริ่มเกิดพีคที่สอง และใช้เส้นนี้เป็นฐานในการคำนวณพื้นที่พีคแรก และลากเส้นจากจุดที่สัญญาณเริ่มวกกลับไปจนถึงตำแหน่ง base line เดิมที่เป็นจุดที่พีคที่สองสิ้นสุด และใช้เส้นนี้เป็นฐานในการคำนวณพื้นที่พีคที่สอง ในขณะที่ในการฉีดครั้งที่ ๒ นั้นเครื่องทำการลาก base line ตามแบบที่ (1) กล่าวคือเริ่มจากจุดเริ่มต้นเกิดพีคแรกไปจนถึงจุดสิ้นสุดพีคที่สอง และลากเส้นในแนวดิ่งจากตำแหน่งสัญญาณเริ่มวกกลับลงมาตัด base line ที่ลากขึ้น และใช้เส้นนี้เป็นตัวแบ่งพื้นที่ที่จะใช้ในการคำนวณพื้นที่พีคแรกและพื้นที่พีคที่สอง
  

ซึ่งจะเห็นว่าถ้าลาก base line ตามแบบที่ (2) จะมีพื้นที่พีคหายไปส่วนหนึ่ง ในกรณีของการฉีดครั้งที่ ๑ และ ๓ ที่พื้นที่พีคที่สองหายไปมากก็เพราะตำแหน่งจุดสัญญาณเริ่มวกกลับนั้นอยู่ค่อนข้างสูงและตำแหน่งสิ้นสุดของพีคที่สองนั้นอยู่ห่างออกมาจากตำแหน่งจุดสัญญาณวกกลับค่อนข้างมาก จึงทำให้เห็นพื้นที่พีคที่สองจากการฉีดครั้งที่ ๑ และครั้งที่ ๓ นั้นน้อยกว่าที่ได้จากการฉีดครั้งที่ ๒ มาก
  

กรณีนี้เกิดค่าของคำสั่ง DRIFT (อัตราการเปลี่ยนแปลงสัญญาณที่ถือว่าสัญญาณกลับมาที่ base line แล้ว) ถ้าเกิดกรณีที่พีคซ้อนกันดังรูป ที่ DRIFT มีค่าต่ำนั้นเครื่องจะลากแนว base line ตามแบบที่ (1) แต่ถ้า DRIFT มีค่าสูงเครื่องจะลากแนว base line ตามแบบที่ (2) ในการทดลองเมื่อวันพฤหัสบดีที่ผ่านมานั้นได้กำหนดให้เครื่อง CR-8A เลือกค่า DRIFT อย่างอัตโนมัติ 
   

แต่จากตัวอย่างที่ยกมาให้นี้ไม่ได้หมายความว่าไม่ว่าในกรณีใดก็ควรจะต้องตั้งค่า DRIFT ไว้ต่ำ มันขึ้นอยู่กับรูปแบบการเหลื่อมซ้อนทับกันของพีค ซึ่งต้องพิจารณาเป็นกรณีไปว่าการเหลื่อมซ้อนทับกันของพีคนั้นเกิดที่ไหน ตัวคู่มือเองก็ระบุเอาไว้เช่นนั้นด้วย ด้วยเหตุนี้ตัวเครื่องอินทิเกรเตอร์จึงบันทึกข้อมูลเอาไว้เพื่อให้ผู้ใช้สามารถนำข้อมูลนั้นมาทำการคำนวณใหม่ได้
  

ปัญหาเช่นนี้เกิดขึ้นเป็นประจำ แต่เนื่องจากเครื่องอินทิเกรเตอร์ที่เราใช้มันจะเก็บข้อมูลได้เพียงแค่การวัดครั้งสุดท้ายเพียงครั้งเดียว พอทำการวัดครั้งต่อไปข้อมูลเก่าจะถูกลบทิ้ง และเวลาใช้นั้นเรามักต้องทำการวัดต่อเนื่องกันหลายครั้ง ทางผมจึงมักจะแนะนำให้บันทึกข้อมูลตัวเลขของโครมาโทแกรมลงแผ่นดิสก์เอาไว้ เพื่อนำมาประมวลผลใหม่ด้วยโปรแกรมสำหรับใช้แยกพีค (เช่น fityk ที่กลุ่มเราใช้เป็นประจำ) ที่ใช้หาพื้นที่พีคของแต่ละพีคที่เหลื่อมซ้อนทับกันได้ดีกว่า 
  

ในกรณีของตัวอย่างที่ยกมานี้โดยส่วนตัวแล้วผมเห็นว่าผลการวิเคราะห์ที่น่าเชื่อถือมากกว่าคือผลที่ได้จากการฉีดครั้งที่ ๒ ในขณะที่ผลที่ได้จากการฉีดครั้งที่ ๑ และ ๓ นั้นแม้ว่าจะได้ค่าใกล้เคียงกัน แต่ก็เป็นค่าที่มีความคลาดเคลื่อนสูงทั้งคู่

ตัวอย่างที่ยกมาในวันนี้เป็นการแสดงให้เห็นว่า เสียงข้างมากก็ใช่ว่าจะถูกต้องเสมอไป เพราะมันอาจเกิดจากการทำผิดซ้ำเดิม ๆ