วันอังคารที่ 10 กันยายน พ.ศ. 2556

ปัญหาการสร้าง calibration curve ของ ICP (การทำวิทยานิพนธ์ภาคปฏิบัติ ตอนที่ ๔๙) MO Memoir : Tuesday 10 September 2556

เทคนิคทางด้าน atomic spectroscopy ไม่ว่าจะเป็นการวัดการดูดกลืน (absorption) หรือการเปล่งแสง (emission) นั้นจัดว่าเป็นเทคนิคที่มีความว่องไว (sensitivity) ในการวัดที่สูง สามารถวัดธาตุในสารตัวอย่างที่ระดับปริมาณ ppm (part per million - ส่วนต่อล้านส่วน) หรือ ppb (part per billion - ส่วนต่อพันล้านส่วน) ได้ แต่นั่นหมายถึงตัวอย่างที่ต้องการวัดปริมาณธาตุนั้นจำเป็นต้องมีธาตุเหล่านั้นที่ความเข้มข้นระดับ ppm ด้วย เพราะถ้าความเข้มข้นของธาตุในสารตัวอย่างสูงเกินไป เครื่องจะวัดไม่ไหว
  
ในกรณีที่เรามีตัวอย่างเป็นของแข็งและต้องการวัดปริมาณธาตุในตัวอย่างนั้น สิ่งที่ต้องกระทำก็คือละลายตัวอย่างในตัวทำละลายที่เหมาะสม เนื่องจากการละลายให้ได้ความเข้มข้นระดับ ppm ในครั้งเดียวเป็นเรื่องยากที่จะทำ (ปัญหาหนักข้อหนึ่งมันอยู่ตรงที่การชั่งสารในปริมาณน้อย ๆ) วิธีการที่ทำกันมากกว่าคือการเตรียมตัวอย่างให้เป็นสารละลายที่ความเข้มข้นสูงก่อน จากนั้นจึงค่อยทำการเจือจางสารละลายนั้นให้อยู่ในระดับความเข้มข้นที่เครื่องสามารถวัดได้
 
แต่วิธีการเจือจางก็ยังมีปัญหาเรื่องความคลาดเคลื่อนอยู่ดี ปัญหาหลักก็คือประสบการณ์ของผู้ที่เตรียมสารละลายในการใช้อุปกรณ์เครื่องแก้วต่าง ๆ ในการวัดปริมาตร

ในสัปดาห์ที่แล้วสมาชิกผู้หนึ่งของกลุ่มเราได้ส่งตัวอย่างไปวิเคราะห์ด้วยเทคนิค inductively coupled plasma หรือที่เรียกย่อว่า ICP ปรากฏว่าผลการวัดที่ได้นั้นเกิดปัญหาขึ้น คือค่าความเข้มข้นที่วัดได้นั้นมันติดลบ ก็เลยได้มีการปรึกษากันระหว่างผมกับทางเจ้าหน้าที่ผู้วิเคราะห์ (เขาเพิ่งจะย้ายมารับงานนี้) 
   
ในการส่งตัวอย่างไปนั้นผู้ส่งตัวอย่างต้องเตรียมสารละลายตัวอย่างและสารละลายที่จะใช้สร้าง calibration curve การเตรียมสารละลายที่ใช้สร้าง calibration curve นั้นจะใช้สารละลายมาตรฐานที่ทราบค่าความเข้มข้นแน่นอน มาเจือจางให้ได้ระดับความเข้มข้นต่าง ๆ กัน ซึ่งหลังจากที่ได้ปรึกษากันแล้วผมก็เสนอว่าปัญหามันน่าจะอยู่ตรงที่การสร้าง calibration curve และความเข้มข้นของสารในตัวอย่างที่นำมาวัด ผมก็เลยขอให้ทางผู้วิเคราะห์นั้นส่งข้อมูลความแรงของสัญญาณที่วัดได้จากตัวอย่างความเข้มข้นต่าง ๆ เพื่อตรวจสอบการสร้าง calibration curve
  
กล่าวคือในการวิเคราะห์นั้น ทางผู้ส่งตัวอย่างส่งสารที่ความเข้มข้น 0, 1, 3, 5, 10 และ 15 ppm ที่เตรียมขึ้นเองเพื่อใช้สร้าง calibration curve ผู้ทำการวิเคราะห์ก็ทำการวัดสัญญาณที่ได้จากสารเหล่านี้ความเข้มข้นละ 3 ครั้งก่อนที่จะหาค่าเฉลี่ย จากนั้นจะใช้ค่าเฉลี่ยที่ได้นั้นมาสร้าง calibration curve โดยกำหนดให้ calibration curve เป็นเส้นตรงที่ตัดผ่านจุดกำเนิด ข้อมูลดิบที่ได้และและผลการคำนวณแสดงไว้ในตารางที่ ๑ ข้างล่าง

ตารางที่ ๑ ข้อมูลดิบที่ได้จากการวัดและข้อมูลที่ทำการปรับแก้แล้ว


ข้อมูลดิบ
เฉลี่ย
เทียบกับค่าเฉลี่ย
สัญญาณ
ppm
ครั้งที่ ๑
ครั้งที่ ๒
ครี้งที่ ๓
ครั้งที่ ๑
ครั้งที่ ๒
ครี้งที่ ๓
ที่ปรับแก้
0
860128.9
854053.3
854289.8
856157.3
3971.6
-2104.0
-1867.5
0.0
1
1372324.5
1371738.1
1372463.0
1372175.2
516167.2
515580.8
516305.7
516017.9
3
2389482.1
2395157.7
2384729.7
2389789.8
1533324.8
1539000.4
1528572.4
1533632.5
5
3390577.3
3392577.0
3403565.6
3395573.3
2534420.0
2536419.7
2547408.3
2539416.0
10
5947784.0
5915905.6
5903768.8
5922486.1
5091626.7
5059748.3
5047611.5
5066328.8
15
8434312.8
8433330.6
8406988.8
8424877.4
7578155.5
7577173.3
7550831.5
7568720.1

รูปที่ ๑ (ซ้าย) สัญญาณข้อมูลดิบที่วัดได้กับความเข้มข้นของสาร (ขวา) ปรับแก้ base line ด้วยการลบสัญญาณที่วัดได้จากตัวอย่างแต่ละความเข้มข้นด้วยสัญญาณที่วัดได้จากตัวอย่างความเข้มข้น 0 ppm

ถ้านำเอาข้อมูลดิบ (หรือที่ตัด base line ทิ้งไปแล้ว) คือความแรงของสัญญาณที่วัดได้กับความเข้มข้นของสารมาตรฐานที่เตรียมขึ้นมาเขียนกราฟ ก็จะได้กราฟดังแสดงในรูปที่ ๑ ข้างบน มองแบบนี้จะเห็นว่าความสัมพันธ์ระหว่างความแรงของสัญญาณกับความเข้มข้นของสารมีลักษณะเป็นกราฟเส้นตรงซึ่งเป็นไปตาม Beer's law
 
อันที่จริง calibration curve ในรูปที่ ๑ ก็ใช้การได้ แต่ถ้าจะดูให้ละเอียดโดยเอาตัวเลขข้อมูลดิบมาตรวจสอบว่าความสัมพันธ์ระหว่างความแรงของสัญญาณกับความเข้มข้นของสารนั้นเป็นเส้นตรงที่ตัดจุดกำเนิดของกราฟหรือไม่ก็จะพบว่ามีปัญหาเล็กน้อย (ดูตารางที่ ๒) กล่าวคือถ้าเอาจุด 0 ppm และ 1 ppm เป็นหลัก จากนั้นตรวจสอบว่าที่ความเข้มข้น 3, 5, 10 และ 15 ppm นั้นสัญญาณแรงเป็น 3, 5, 10 และ 15 เท่าของสัญญาณที่ 1 ppm หรือไม่ก็พบว่าความแรงของสัญญาณที่ความเข้มข้น 3, 5, 10 และ 15 ppm นั้น "ต่ำกว่า" 3, 5, 10 และ 15 เท่าของสัญญาณที่ 1 ppm อยู่เล็กน้อย โดยยิ่งห่างจุด 1 ppm มากก็ยิ่งต่ำลงมากขึ้น

ตารางที่ ๒ เปรียบเทียบค่าเฉลี่ยสัญญาณที่วัดได้จริงกับค่าที่ควรเป็นถ้าอ้างอิงจุด 1 ppm และ 15 ppm
ppm
เฉลี่ย
ref ที่ 1 ppm
ref ที่ 15 ppm
0
0.0
0.0
0.0
1
516017.9
516017.9
504581.3
3
1533632.5
1548053.6
1513744.0
5
2539416.0
2580089.3
2522906.7
10
5066328.8
5160178.7
5045813.4
15
7568720.1
7740268.0
7568720.1

และในทางกลับกันถ้าเอาจุด 0 ppm และ 15 ppm เป็นหลัก จากนั้นตรวจสอบว่าที่ความเข้มข้น 1, 3, 5 และ 10 ppm นั้นสัญญาณแรงเป็น 1/15, 3/15, 5/15 และ 10/15 เท่าของสัญญาณที่ 15 ppm หรือไม่ก็พบว่าความแรงของสัญญาณที่ความเข้มข้น 1, 3, 5 และ 10 ppm นั้น "สูงกว่า" 1/15, 3/15, 5/15 และ 10/15 เท่าของสัญญาณที่ 15 ppm อยู่เล็กน้อยเช่นเดียวกัน โดยยิ่งเข้าใกล้จุด 0 ppm มากก็ยิ่งสูงขึ้นมากขึ้น (ค่าสัมพัทธ์)

ปัญหานี้เป็นปัญหาที่เกิดขึ้นเป็นประจำเวลาที่ตวงของเหลวปริมาตรน้อย ๆ ด้วยอุปกรณ์ที่เพียงชิ้นเดียวก็สามารถตวงของเหลวได้หลายปริมาตรเช่น graduate pipette หรือบิวเรต หรือแม้แต่การใช้ syringe ขนาดใหญ่ในการฉีดตัวอย่างปริมาตรน้อย (เช่นเอา syringe ขนาด 1 ไมโครลิตรมาฉีดตัวอย่างขนาด 0.1-0.2 ไมโครลิตร) ทั้งนี้เนื่องจากอุปกรณ์เหล่านี้จะมีความคลาดเคลื่อนในการวัดปริมาตรอยู่ในระดับหนึ่ง โดยไม่ขึ้นกับปริมาตรที่ทำการตวง
สมมุติว่าเราใช้ graduate pipette ขนาด 10 ml ในการตวงของเหลวปริมาตร 10 ml ความคลาดเคลื่อนจากการตวงจะอยู่ที่ฝีมือผู้ทำการตวงของเหลวในการอ่านสเกลและปรับปริมาตรของเหลวให้ตรงกับขีด และปริมาตรของเหลวที่ตกค้างอยู่ที่ปลายปิเปต ซึ่งความคลาดเคลื่อนตรงนี้จะมีขนาดคงที่ ไม่ขึ้นกับปริมาตรของเหลวที่ทำการตวง ถ้าสมมุติว่าขนาดความคลาดเคลื่อนสองส่วนนี้รวมกันเท่ากับ 0.02 ml ดังนั้นถ้าเรานำเอา graduate pipette ตัวนี้มาตวงของเหลว 10 ml ก็จะมีสิทธิคลาดเคลื่อนไปได้ (0.02/10.0)*100 = 0.2%
  
แต่ถ้าเรานำเอา graduate pipette ตัวนี้มาตวงของเหลวปริมาตร 1.0 ml ความคลาดเคลื่อนที่เกิดจากการอ่านสเกล การปรับระดับของเหลวให้ตรงขีด และปริมาตรของเหลวที่ค้างอยู่ที่ปลายก็ยังคงเท่ากับ 0.02 ml เหมือนเดิม แต่ในขณะนี้เมื่อเทียบกับปริมาตร 1.0 ml ที่ทำการตวง การตวงจะมีควรคลาดเคลื่อนเพิ่มเป็น (0.02/1.0)*100 = 2.0% ดังนั้นเพื่อที่จะลดขนาดความคลาดเคลื่อนสัมพัทธ์ตรงนี้ จึงไม่ควรตวงสารในปริมาณน้อยเมื่อเทียบกับขนาดของอุปกรณ์ที่ใช้ตวง


ในกรณีนี้สิ่งที่ผมคิดว่าพวกเราควรต้องปฏิบัติคือให้ไปดูว่าสารมาตรฐานที่เขาซื้อมานั้นมีความเข้มข้นเท่าใด ก็ให้เตรียมสารตัวอย่างให้มีความเข้มข้นประมาณนั้น เช่นสมมุติว่าโลหะที่เราต้องการวัดนั้นมีสารมาตรฐานเข้มข้น 15 ppm การสร้าง calibration curve ก็ใช้จุด 2 คือ 0 ppm กับ 15 ppm ที่ผมคิดว่าใช้เพียงแค่สองจุดได้ก็เพราะความสัมพันธ์ระหว่างความแรงสัญญาณและความเข้มข้นนั้นเป็นเส้นตรงที่ดีและผ่านจุดกำเนิด (ดูรูปที่ ๑)

จุด 0 ppm ได้จากการวัดตัวทำละลายเปล่า ตัวทำละลายเปล่านี้คือตัวทำละลายที่เราใช้ละลายตัวเร่งปฏิกิริยา ที่ต้องทำการวัดตัวทำละลายเปล่าก็เพื่อหาว่าสัญญาณของตัวทำละลายเปล่าเมื่อไม่มีตัวเร่งปฏิกิริยาละลายอยู่นั้นแรงเท่าใด ส่วนจุด 15 ppm ก็วัดจากสารละลายมาตรฐานนั้นเลย เมื่อได้ผลการวิเคราะห์ออกมาก็เทียบกับcalibration curve เส้นนี้

ส่วนการเตรียมสารละลายตัวอย่างนั้นก็ให้คำนวณก่อนว่าควรนำตัวเร่งปฏิกิริยาหนักกี่กรัม ละลายในตัวทำละลายกี่ ml จึงจะได้ความเข้มข้นของโลหะที่ต้องการวัดในสารละลายนั้นเข้มข้นประมาณ 15 ppm (เราทราบปริมาณโลหะโดยประมาณของตัวอย่างจากปริมาณโลหะที่เราเติมเข้าไปตอนสังเคราะห์ตัวเร่งปฏิกิริยา)

ไม่มีความคิดเห็น: