การทำวิทยานิพนธ์ภาคปฏิบัติ ตอนที่ ๓๙ ตัวอย่างการแยกพีค GC ที่ไม่เหมาะสม MO Memoir : Friday 24 August 2555

สมาชิกใหม่กลุ่มเราบางคนอาจจะแปลกใจว่าทำไมเวลาที่กลุ่มเราวิเคราะห์ผลด้วยเครื่อง GC ผมมักจะย้ำให้ทำการบันทึกข้อมูลโครมาโทแกรมลงแผ่นดิสก์เอาไว้เสมอ และบ่อยครั้งที่จะพบว่ากลุ่มเราจะนำเอาโครมาโทแกรมที่ได้นั้นมาทำการวิเคราะห์เพื่อคำนวณพื้นที่พีคที่ได้ แทนที่จะอ่านค่าตัวเลขที่เครื่อง integrator คำนวณให้หรืออ่านจากโปรแกรมที่มากับคอมพิวเตอร์ตัวที่ควบคุม GC

เหตุผลก็คือจากประสบการณ์ของกลุ่มเรานั้น ค่าตัวเลขพื้นที่พีคที่เครื่อง integrator หรือโปรแกรมที่มากับตัวเครื่องคำนวณให้นั้นมันจะใช้ได้ดีก็ต่อเมื่อ

(ก) เส้น base line นั้นไม่มีปัญหา เช่นอยู่ต่ำเกินไป หรือพีคอยู่บริเวณที่เส้น base line มีการเปลี่ยนแปลงที่ไม่ราบเรียบ

(ข) พีคออกมาปรกติ ไม่มีรูปร่างหัวตัด ซึ่งพีคหัวตัดนี้เกิดจากการที่ขนาดตัวอย่างที่ฉีดเข้าไปนั้นมากเกินกว่าที่ detector จะวัดได้ กล่าวอีกนัยหนึ่งคือ detector อิ่มตัวนั่นเอง และ

(ค) พีคไม่มีการเหลื่อมซ้อน

ในบันทึกฉบับนี้จะขอยกตัวอย่างปัญหาพีคเหลื่อมซ้อน โดยจะมาดูกันว่าโปรแกรมที่มากับตัวเครื่อง GC นั้นมันแบ่งพีคอย่างไร ทำไมมันจึงไม่เหมาะสม

รูปที่ ๑ ภาพโดยรวมของโครมาโทแกรมที่ได้จากการวิเคราะห์ตัวอย่างหนึ่งด้วย capillary column เส้นสีม่วงคือการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิคอลัมน์

โครมาโทแกรมที่นำมาแสดงในรูปที่ ๑ และภาพขยายในรูปที่ ๒ ผมไปเอามาจากเครื่อง GC เครื่องหนึ่ง ผมเห็นช่างเขามาทำการติดตั้งและสอนการใช้งาน ทั้งวิธีการใช้เครื่องและการประมวลผล อันที่จริงซอร์ฟแวร์ที่เขาใช้ก็เป็นตัวเดียวกันกับซอร์ฟแวร์ที่กลุ่มเราใช้ในการควบคุมเครื่อง GC-2014 FPD และ GC-2014 ECD & PDD แต่โครมาโทแกรมตัวอย่างที่เอามาให้ดูนั้นมันมีอะไรหลายต่อหลายอย่างให้ดูในกราฟรูปเดียว

ถ้าทำการวิเคราะห์ที่อุณหภูมิคอลัมน์คงที่ รูปร่างของพีคที่เราจะเห็นคือด้านขาขึ้นของพีคนั้นจะชันกว่าด้านขาลง (เห็นได้ชัดในกรณีของ packed column แต่ในกรณีของ capillary column จะดูยาก ถ้าสังเกตตำแหน่งที่พีคกลับมายัง base line จะดูง่ายกว่า) ถ้าพีคที่ได้มีลักษณะที่ด้านขาขึ้นมีความชันน้อยกว่าด้านขาลง เป็นไปได้ว่าขนาดของตัวอย่างมากเกินกว่าที่คอลัมน์จะรับได้ (คอลัมน์ท่วม)

โครมาโทแกรมที่เอามาให้ดูนั้นสัญญาณพีคด้านขาขึ้นมีความชันน้อยกว่าสัญญาณด้านขาลงอยู่เล็กน้อย (ดูยากอยู่เหมือนกัน) สาเหตุเป็นเพราะมีการเพิ่มอุณหภูมิคอลัมน์ให้สูงขึ้นอย่างช้า ๆ ในระหว่างทำการวิเคราะห์ (ตามเส้นสีม่วงในรูปที่ ๑) สัญญาณทางด้านหน้าของพีคนั้นเป็นของสารตัวอย่างที่หลุดออกมาที่อุณหภูมิคอลัมน์ที่ต่ำกว่าทางสารตัวอย่างที่หลุดออกจากคอลัมน์ทีหลัง ซึ่งหลุดออกมาที่อุณหภูมิที่สูงกว่า (อุณหภูมิที่สูงขึ้นจะทำให้การดูดซับแย่ลง สารจะหลุดออกมาได้ง่ายขึ้น)

เดิมนั้น การหาพื้นที่พีคจะใช้วิธีการ "ตัดกระดาษแล้วนำไปชั่งน้ำหนัก" เพราะผลการวิเคราะห์ออกมาในรูปเส้นกราฟที่วาดลงบนกระดาษ (ด้วยเครื่อง recorder) ดังนั้นจึงสามารถใช้น้ำหนักกระดาษที่ตัดเป็นรูปพีคออกมาแทนพื้นที่พีคได้ เช่นถ้าพีคมีขนาดใหญ่ เมื่อตัดกระดาษรูปพีคนั้นออกมา น้ำหนักกระดาษที่ตัดออกมาก็จะมากตามไปด้วย เทคนิคนี้ใช้ได้ดีกับพีคที่ไม่มีการเหลื่อมซ้อนกัน แต่ถ้าพีคมีการเหลื่อมซ้อนกันก็จะเปิดปัญหาเรื่องความถูกต้อง

ในยุคถัดมาเรื่อยมาจนถึงปัจจุบัน แม้ว่าจะมีคอมพิวเตอร์ที่มีสมรรถนะสูง แต่ก็ยังเห็นโปรแกรมที่มากับตัวเครื่องยังหาพื้นที่พีคที่เหลื่อมซ้อนโดยใช้เทคนิคอิงจากการตัดกระดาษอยู่ แทนที่จะใช้การทำ peak deconvolution ที่จะให้พื้นที่พีคที่ถูกต้องมากกว่า

เราลองมาดูภาพขยายโครมาโทแกรมของรูปที่ ๑ ในช่วงเวลา18.0-25.0 นาทีที่นำมาแสดงในรูปที่ ๒ กัน

ตำแหน่งที่ (1) เป็นลักษณะของพีคเล็กอยู่บนส่วนหางของพีคที่ใหญ่กว่ามาก โดยจุดเริ่มเกิดพีคเล็กและจุดสิ้นสุดของพีคเล็กนั้นอยู่ในช่วงที่สัญญาณพีคใหญ่ยังลดลงอย่างรวดเร็ว ในกรณีนี้การสร้าง base line สำหรับคำนวณพื้นที่พีคเล็กด้วยการลากเส้นตรงเชื่อมจุดเริ่มเกิดพีคเล็กกับจุดสิ้นสุดพีคเล็กเข้าด้วยกันจะให้ผลการคำนวณพื้นที่พีคเล็กที่เข้าได้กับการใช้การทำ peak deconvolution

กรณีนี้แตกต่างไปจากกรณีของพีค NO บนส่วนหางของพีค O₂ ที่เคยกล่าวไว้ ^(๑) ซึ่งในกรณีนั้นพีค NO เกิดในช่วงที่พีค O₂ กำลังลดต่ำลงก็จริง แต่การสิ้นสุดพีค NO นั้นเกิดหลังการสิ้นสุดพีค O₂ ทำให้การลากเส้น base line ต้องทำด้วยวิธีการที่แตกต่างกันออกไป

ตำแหน่งที่ (2) เป็นลักษณะของพีคเล็กเกิดคร่อมส่วนหางของพีคใหญ่ ซึ่งเป็นลักษณะทำนองเดียวกันกับกรณีของพีค NO บนส่วนหางของพีค O₂ ที่เคยกล่าวไว้ ^(๑) แต่จากรูปที่ ๒ จะเห็นว่าการลากเส้น base line สำหรับการคำนวณพื้นที่พีคนั้น โปรแกรมใช้วิธีเริ่มลากเส้นจากจุดที่สัญญาณมีการวกกลับ (ลูกศรสีแดง) ไปจนถึงจุดที่สัญญาณกลับคืนมายังระดับเดียวกันกับระดับที่เริ่มเกิดพีคใหญ่ (ลูกศรสีเขียว) ซึ่งจะเห็นว่ามีพื้นที่พีคส่วนหนึ่ง (ตรงปลายหัวลูกศรสีน้ำเงิน) ที่ไม่ถูกนำมาคิดคำนวณ พื้นที่ตรงส่วนนี้จะไม่ปรากฏในการคำนวณพื้นที่พีคใหญ่ก่อนหน้า และไม่ปรากฏในการคำนวณพื้นที่พีคที่คร่อมจุดสิ้นสุดพีคใหญ่นี้ด้วย ทำให้ผลการคำนวณดุลมวลสารออกมาต่ำกว่าความเป็นจริง

ตำแหน่งที่ (3) เป็นลักษณะของพีคที่เกิดก่อนมีขนาดเล็กกว่าพีคที่เกิดทีหลัง พีคใหญ่ที่เกิดทีหลังนั้นเกิดหลังจากสัญญาณพีคเล็กที่เกิดก่อนนั้นเริ่มลดลง แต่ระดับสัญญาณยังห่างจาก ในกรณีนี้แทนที่โปรแกรมจะทำการแบ่งพีคด้วยการลากเส้น base line ในทำนองเดียวกันกับตำแหน่งที่ (2) โปรแกรมกลับใช้วิธีการลากเส้นดิ่ง (ลูกศรสีน้ำเงิน) ลงมาจากจุดที่สัญญาณวกกลับลงมายังเส้น base line ที่เป็นเส้นที่ลากเชื่อมระหว่างจุดเริ่มเกิดพีคที่อยู่หน้า (ลูกศรสีแดง) และจุดสิ้นสุดของพีคที่ตามหลังมาก (ลูกศรสีเขียว)

อันที่จริงการในกรณีของพีคที่เหลื่อมซ้อนกันนั้น โปรแกรมจะลากเส้น base line แบบตำแหน่งที่ (2) หรือตำแหน่งที่ (3) ไม่ได้ขึ้นอยู่กับขนาดของพีคที่เกิดก่อนหรือหลังว่าใครมีขนาดใหญ่กว่ากัน แต่ขึ้นอยู่กับการกำหนดพารามิเตอร์ต่าง ๆ ในการระบุ จุดเกิดพีค จุดสิ้นสุดพีค และแนวเส้น base line มากกว่า

ตำแหน่งที่ (4) เป็นรูปแบบที่ดูแล้วอยู่ก้ำกึ่งระหว่างรูปแบบของตำแหน่งที่ (2) และตำแหน่งที่ (3) ในกรณีนี้โปรแกรมกำหนดให้เส้น base line นั้นลากจากจุดสิ้นสุดของพีคใหญ่ที่เกิดก่อนหน้า ไปจนถึงจุดสิ้นสุดของพีคตำแหน่งที่ (4) (ตามแนวเส้นสีม่วง) จากนั้นทำการแบ่งพีคตำแหน่งที่ (4) ออกจากพีคเล็กที่อยู่ก่อนหน้าด้วยการลากเส้นในแนวดิ่งจากตำแหน่งที่สัญญาณเริ่มเกิดการวกกลับ (ปลายลูกศรสีแดง) จนมาถึงระดับเส้น base line ที่ลากเอาไว้

จะเห็นว่ารูปแบบต่าง ๆ ในการแยกพีคที่กล่าวมาข้างต้นนั้นเป็นรูปแบบที่อิงจากเทคนิค "ตัดกระดาษแล้วนำไปชั่งน้ำหนัก" ถ้าจะถามว่าใช้ได้ไหม ก็คงต้องตอบว่าในกรณีที่อุปกรณ์ที่ใช้นั้นไม่สามารถบันทึกผลการวิเคราะห์ออกมาเป็นจุดข้อมูล (เวลา,ความแรงของสัญญาณ) ได้ ก็คงไม่สามารถทำอะไรได้มากกว่านี้ แต่ก็ต้องยอมรับว่าด้วยว่ามันมี "ความคลาดเคลื่อน" อยู่ในระดับหนึ่ง ทางที่ดีคือพยายามปรับแต่งภาวะการทำงานของเครื่อง GC เพื่อให้พีคเกิดการเหลื่อมซ้อนกันน้อยที่สุดก่อน

แต่ถ้าสามารถบันทึกผลการวิเคราะห์ในรูปไฟล์ (เวลา,ความแรงของสัญญาณ) ได้ ก็ควรที่จะนำเอาข้อมูลที่ได้ไปทำการ deconvolution พีคที่ซ้อนทับกันอยู่ ซึ่งจะทำให้ได้ผลการวิเคราะห์ที่ถูกต้องมากกว่า โปรแกรมที่ใช้ในการแยกพีคที่ซ้อนทับกันที่กลุ่มเราใช้อยู่ในขณะคือ fityk เวอร์ชั่น 0.9.7 (เป็น freeware ใช้งานฟรี)

หมายเหตุ

(๑) ดู Memoir ปีที่ ๕ ฉบับที่ ๔๘๕ วันเสาร์ที่ ๒๘ กรกฎาคม ๒๕๕๕ เรื่อง "GC-2014 ECD & PDD ตอนที่ ๓๓ การหาพื้นที่พีค NO

 รูปที่ ๒ ภาพขยายของโครมาโทแกรมในรูปที่ ๑ ในช่วงเวลา 18.0-25.0 นาที แสดงการลากเส้น base line (เส้นสีน้ำตาล) และการแบ่งพีค (ตรงลูกศรสีน้ำตาลเล็ก ๆ ในรูป) เพื่อคำนวณพื้นที่พีคด้วยโปรแกรมที่มากับตัวเครื่อง