วันเสาร์ที่ 22 กันยายน พ.ศ. 2555

ความสัมพันธ์ระหว่างค่าการดูดกลืนแสง (Absorbance) กับความเข้มข้น MO Memoir : Saturday 22 September 2555

เนื้อหาในบันทึกฉบับนี้เกี่ยวข้องกับบันทึกก่อนหน้านี้ ๒ ฉบับคือ
ปีที่ ๓ ฉบับที่ ๒๖๐ วันพุธที่ ๑๖ กุมภาพันธ์ ๒๕๕๔ เรื่อง "Distribution functions"
ปีที่ ๓ ฉบับที่ ๒๖๓ วันพฤหัสบดีที่ ๒๒ กุมภาพันธ์ ๒๕๕๔ เรื่อง "UV-Vis - peak fitting"

เรื่องทั้งเรื่องมันเริ่มจากเมื่อประมาณ ๒ สัปดาห์ที่แล้ว ระหว่างนั่งฟังการนำเสนอวิธีการการแยกสารธรรมชาติจากพืชสมุนไพร ผู้บรรยายได้เล่าถึงวิธีการที่เขาใช้ในการหาปริมาณสารสกัดที่ได้ซึ่งใช้เทคนิคการวัดการดูดกลืนคลื่นแสงที่ความยาวคลื่นหนึ่ง ซึ่งผมเห็นว่าวิธีการที่เขาเลือกใช้นั้นมันมีประเด็นที่ต้องพิจารณาให้ดี เพราะสามารถส่งผลต่อการแปลผลการทดลองที่ได้

แต่ก่อนอื่นเราลองมาทบทวนเรื่องการวัดการดูดกลืนคลื่นแสงกันสักหน่อยดีกว่า

การใช้เทคนิคการวัดการดูดกลืนคลื่นแสงเป็นเทคนิคที่มีการนำมาใช้ในการระบุชนิดของสารและวัดความเข้มข้น ของสารในสารละลาย (ส่วนใหญ่ก็เป็นสารละลายในน้ำ) ช่วงความยาวคลื่นของแสงที่มีการใช้กันมากในการวัดความเข้มข้นคือแสงช่วง UV-Vis

ในการวัดความเข้มข้นนั้น ผู้ทำการทดลองจะต้องทำการทดสอบก่อนว่าตัวอย่างที่ต้องการวัดนั้นดูดกลืนคลื่นแสงที่ความยาวคลื่นใดมากที่สุด (หาตำแหน่งการดูดกลืนที่เด่นชัด) ซึ่งทำได้โดยการนำเอาสารตัวอย่างนั้นไปวัดการดูดกลืนคลื่นแสงที่ความยาวคลื่นต่าง ๆ จากนั้นจะใช้ความยาวคลื่นที่พบการดูดกลืนที่เด่นชัดที่สุดนั้นเป็นตำแหน่งความยาวคลื่นที่จะวัดความเข้มข้นของสารตัวอย่าง

ถ้าให้ I0 คือความเข้มของแสงที่ส่องออกมาจากแหล่งกำเนิด I คือความเข้มของแสงที่ส่องผ่านสารตัวอย่าง ค่าการส่องผ่าน (Transmittance - T) ซึ่งนิยมรายงานผลในรูปของร้อยละ จะคำนวณได้จากสมการ

%T = I/I0 x 100
 
อีกหน่วยหนึ่งที่นิยมใช้กันในการรายงานผลคือค่าการดูดกลืน (Absorbance - A) ซึ่งคำนวณได้จากสมการ

A = log (I0/I)
 
ค่า %T และ A สัมพันธ์กันตามสมการ

A = 2 - log(%T)

ต่อไปเราจะลองพิจารณาดูความสัมพันธ์ระหว่าง ระยะทางที่แสงเดินทางผ่านตัวอย่างหรือความเข้มข้นของตัวอย่าง กับค่า %T หรือ A
 
ในการดูดกลืนคลื่นแสงนั้น ปริมาณแสงที่ถูกดูดกลืนจะไม่ขึ้นอยู่กับความเข้มของแสงที่ตกกระทบ แต่จะขึ้นอยู่กับระยะทางที่แสงเดินทางผ่านหรือความเข้มข้นของสารตัวอย่าง กล่าวคือสมมุติว่าถ้าเราให้แสงเดินทางผ่านตัวอย่างเป็นระยะทาง 1 หน่วยแล้วพบว่าแสงผ่านได้เพียง 50% (%T = 50%) ดังนั้นถ้าเราให้แสงเดินทางผ่านตัวอย่างเป็นระยะทาง 2 หน่วย แสงที่ผ่านออกมาก็จะเหลือเพียง 25% (%T = 25%) และถ้าแสงต้องเดินทางผ่านตัวอย่างเป็นระยะทาง 3 หน่วยความเข้มของแสงที่ผ่านออกมาก็จะเหลือเพียง 12.5 % (%T = 12.5%) (ดูรูปที่ ๑ (บน) ประกอบ ถ้าเปลี่ยนระยะทางเป็นความเข้มข้นก็จะให้ผลแบบเดียวกัน) ดังนั้นถ้าเราเขียนกราฟระหว่างระยะทาง/ความเข้มข้นกับ %T หรือ A ก็จะได้กราฟดังรูปที่ ๑ (ล่าง)

รูปที่ ๑ (บน) ตัวอย่างการลดลงของความเข้มของแสงเมื่อต้องเดินทางผ่านตัวกลาง (ล่าง) กราฟความสัมพันธ์ระหว่าง ระยะทาง/ปริมาณ กับค่า %Transmittance และ Absorbance

จากรูปที่ ๑ จะเห็นว่าความสัมพันธ์ระหว่างระยะทาง/ปริมาณกับค่าการดูดกลืน A นั้นมีความสัมพันธ์ที่เป็นเส้นตรงที่ดีกว่าความสัมพันธ์ระหว่างระยะทาง/ปริมาณกับค่าร้อยละการส่องผ่าน (%T) ดังนั้นในการวิเคราะห์เชิงปริมาณจึงนิยมวัดการดูดกลืนในรูปของ A มากกว่า %T

ทฤษฎีที่นำมาใช้กันในการหาความสัมพันธ์ระหว่างปริมาณแสงที่ส่องผ่านสารตัวอย่างหรือถูกสารตัวอย่างดูดกลืนและปริมาณสารตัวอย่างนั้นได้แก่กฎของเบียร์-แลมเบิร์ต (Beer-Lambert's Law) ซึ่งบ่อยครั้งมักจะเรียกสั้น ๆ ว่ากฎของเบียร์ (Beer's Law) ซึ่งกล่าวว่า

A = e.b.c
 
เมื่อ e คือค่าคงที่การดูดกลืนคลื่นแสงซึ่งขึ้นอยู่กับความยาวคลื่นและชนิดของสาร b คือระยะทางที่แสงเดินทางผ่านซึ่งโดยปรกติในการวัดนั้นระยะทางนี้จะคงที่ และ c คือความเข้มข้นของสาร ดังนั้นถ้าจะว่าตามกฎของเบียร์แล้ว สำหรับสารหนึ่งที่มีค่า e คงที่และการวัดการดูดกลืนแสงด้วยเครื่องมือที่มีค่า b คงที่ ความเข้มข้นของแสงควรแปรผันตรงกับค่าการดูดกลืนคลื่นแสงที่วัดได้ ซึ่งในความเป็นจริงความสัมพันธ์ที่เป็นเส้นตรงดังกล่าว (ระหว่างระยะทาง/ปริมาณกับค่า A ดังที่แสดงในรูปที่ ๑) จะใช้ได้ดีในกรณีที่สารตัวอย่างมีความเข้มข้นไม่สูงมากเกินไปและไม่ต่ำเกินไป เพราะที่ความเข้มข้นสูงมากเกินไปหรือต่ำเกินไปจะมีการเบี่ยงเบนเกิดขึ้น โดยบางรายงานนั้นกล่าวว่าช่วงที่ความสัมพันธ์มีความเป็นเส้นตรงที่ดีนั้นคือช่วงที่ค่า A อยู่ระหว่าง 0.2-0.8

ดังนั้นในการวิเคราะห์เชิงปริมาณ (quantitative analysis) เพื่อตัดปัญหาเรื่องความสัมพันธ์ที่ไม่เป็นเส้นตรง จึงควรใช้ calibration curve เป็นตัวบ่งบอกปริมาณ แทนที่จะใช้กฎของเบียร์
 
ในการสร้าง calibration curve นั้นผู้ทำการทดลองต้องทำการเตรียมสารละลายมาตรฐานที่ความเข้มข้นต่าง ๆ กัน และนำมาวัดค่าการดูดกลืน (A) จากนั้นจึงสร้างกราฟความสัมพันธ์ระหว่างค่าการดูดกลืน (A) และความเข้มข้นของสาร และใช้กราฟดังกล่าวในการหาความเข้มข้นของสารที่ต้องการวัดในสารตัวอย่าง

นี่คือประเด็นที่เราจะคุยกันใน Memoir ฉบับนี้

ประเด็นคำถามที่ผมยกขึ้นมาในการบรรยายดังกล่าวคือ ในการค่าการดูดกลืนนั้น ผู้ทำการทดลองเลือกใช้ค่าที่ได้จากการวัดที่ค่าความยาวคลื่นใดความยาวคลื่นหนึ่งเพียงค่าเดียวเท่านั้น โดยไม่ได้มีการพิจารณาภาพสเปกตรัมโดยรวม การใช้การวัดที่ค่าความยาวคลื่นเฉพาะเพียงค่าเดียวนั้นใช้ได้ดีในกรณีที่สารตัวอย่างของเราเป็นสารบริสุทธิ์ แต่ถ้าหากสารตัวอย่างของเรานั้นมีสารอื่นปนอยู่ด้วย และสารเหล่านั้นก็ให้ค่าการดูดกลืนคลื่นแสงที่ความยาวคลื่นใกล้เคียงกัน 
 
คำถามก็คือการดูดกลืนคลื่นแสงที่ความยาวคลื่นข้างเคียงนั้นส่งผลต่อค่าการดูดกลืนของความยาวคลื่นแสงที่เราต้องการวัดหรือไม่

เวลาที่เราบอกว่าสารใดสารหนึ่งให้พีคการดูดกลืนคลื่นแสงที่ความยาวคลื่นใดนั้น เช่นสมมุติว่าให้พีคที่ 380 nm ก็ไม่ได้หมายความว่าสารนั้นจะดูดกลืนคลื่นแสงที่เฉพาะความยาวคลื่น 380 nm และที่ความยาวคลื่นข้าง ๆ (เช่น 381 หรือ 379 nm) จะไม่มีการดูดกลืน แต่มันหมายความว่าพีคการดูดกลืนนั้นมีจุดสูงสุดที่ตำแหน่งความยาวคลื่น 380 nm และการดูดกลืนที่ความยาวคลื่นข้างเคียงนั้นจะต่ำกว่า รูปร่างพีคการดูดกลืนคลื่นแสงนั้นมีลักษณะพีคเป็นรูปร่างที่เข้ากับฟังก์ชัน Gaussian distribution (ดูบันทึกฉบับที่ ๒๖๐ และ ๒๖๓)

ที่นี้เราจะมาลองดูว่าขนาดและความกว้างของพีคที่อยู่เคียงข้างนั้นจะส่งผลอย่างไรบ้างต่อความสูงของพีคที่เราต้องการอ่านค่า

รูปแบบหนึ่งของสมการ Gaussian distribution function คือ

ในสมการข้างบน a คือ amplitude หรือความสูงของพีคที่ตำแหน่งกึ่งกลาง b คือตำแหน่งกึ่งกลางพีค และ c เป็นพารามิเตอร์ที่สัมพันธ์กับความกว้างของพีค ณ ตำแหน่งกึ่งกลางความสูง (Full Width at Half Maximum - FWHM)

สมมุติว่าเรามีพีคการดูดกลืนคลื่นแสง ๒ พีคที่อยู่ห่างกัน 20 nm โดยพีคแรกมีกึ่งกลางอยู่ที่ตำแหน่งความยาวคลื่น 380 nm (b = 380) และพีคที่สองมีกึ่งกลางอยู่ที่ตำแหน่งความยาวคลื่น 400 nm (b = 400) โดยให้พีคทั้งสองนั้นมี amplitude เท่ากันคือ 1.0 รูปที่ ๒ แสดงกราฟของพีคแต่ละพีคและพีคที่เป็นผลรวมของทั้งสองพีค เมื่อพีคนั้นมีค่า FWHM (ค่า c) แตกต่างกันไป

รูปที่ ๒ ผลรวมพีค Gaussian สองพีคที่มีศูนย์กลาง (b) อยู่ที่ตำแหน่ง 380 nm และ 400 nm และมีความสูงเท่ากันคือ a = 1.00 แต่มีค่า FWHM แตกต่างกันคือ (บนซ้าย) c = 5 (บนขวา) c = 10 (ล่าง) c = 20

ลักษณะของพีค Gaussian นั้นความกว้างที่ฐานของพีคจะประมาณ 4 เท่าของค่า FWHM (ค่า c) จากรูปที่ ๒(บนซ้าย) จะเห็นได้ว่าสำหรับพีคที่อยู่ห่างกัน 20 nm นั้นในกรณีที่ c มีค่าไม่เกิน 1/4 ของระยะห่างระหว่างศูนย์กลางของพีค (ในรูปนี้ค่า c = 5) ส่วนฐานของแต่ละพีคจะลู่เข้าหาแกน x ก่อนถึงตำแหน่งศูนย์กลางของพีคที่อยู่เคียงข้าง ถ้าพิจารณาความสูงของพีคแต่ละพีค (เส้นสีน้ำเงินกับเส้นสีส้ม) กับเส้นสัญญาณรวม (เส้นสีเขียว) จะเห็นว่าค่าความสูงที่อ่านได้นั้นไม่แตกต่างกัน

แต่พอค่า FWHM (ค่า c) เพิ่มมากขึ้น เช่นในกรณีของรูปที่ ๒(บนขวา) ที่ค่า c = 10 จะเห็นว่าสัญญาณรวมที่ได้นั้นแตกต่างไปจากสัญญาณของแต่ละพีค กล่าวคือเห็นเป็นพีคหัวป้านเพียงพีคเดียวที่มีตำแหน่งศูนย์กลางอยู่ที่ 390 nm และความสูงเพิ่มเป็น 1.213 (เพิ่มมากขึ้น 21%) และเมื่อค่า c เพิ่มมากขึ้นไปอีกเช่นเพิ่มเป็น 20 ดังกรณีที่แสดงในรูปที่ ๒(ล่าง) จะเห็นว่าพีคที่ได้นั้นจะเห็นเป็นพีคใหญ่เพียงพีคเดียวที่มีตำแหน่งศูนย์กลางอยู่ที่ประมาณ 390 nm และมีความสูง 1.765 (เพิ่มมากขึ้น 76.5%)

แต่ถ้าเราทำการ deconvolution สัญญาณรวมออกมาเป็นพีคย่อยสองพีค เราจะพบว่าทั้งสามกรณีนั้นพีคที่ตำแหน่ง 380 nm และ 400 nm มีความสูงเท่ากันคือ 1.00

รูปที่ ๓ ผลรวมพีค Gaussian สองพีคที่มีศูนย์กลาง (b) อยู่ที่ตำแหน่ง 380 nm และ 400 nm โดยคงความสูงของพีคที่ตำแหน่ง 380 nm ไว้ที่ a = 1.00 (บนซ้าย) c = 10 โดยพีคที่ 400 nm มีค่า a = 0.50 (บนขวา) c = 20 โดยพีคที่ 400 nm มีค่า a = 0.50 และ (ล่าง) c = 20 โดยพีคที่ 400 nm มีค่า a = 0.20
 
ที่นี้เราลองมาดูกรณีที่สอง โดยที่ยังคงตำแหน่งศูนย์กลางของพีคทั้งสองไว้ที่ตำแหน่งเดิม โดยในกรณีนี้เราจะลองสมมุติว่าพีคที่เราต้องการหาความสูงนั้นคือพีคที่ตำแหน่ง 380 nm แล้วเราจะมาลองดูว่าพีคข้างเคียงที่ตำแหน่ง 400 nm นั้นจะส่งผลอย่างไรต่อความสูงของพีคที่ตำแหน่ง 380 nm เมื่อพีคที่ตำแหน่ง 400 nmนั้นมีค่า a เปลี่ยนไปที่ค่า c แตกต่างกัน

ในรูปที่ ๓ จะเห็นได้ว่าเมื่อพีคมีการเหลื่อมซ้อนกัน ความสูงของพีคเล็กที่อยู่เคียงข้างสามารถส่งผลกระทบต่อความสูงของพีคใหญ่ที่อยู่ใกล้เคียงได้ เช่นในกรณีของรูปบนซ้ายที่มีค่า c = 10 พบว่าจากสัญญาณรวมนั้น (เส้นสีเขียว) จะเห็นพีคใหญ่ที่ตำแหน่งประมาณ 382 nm โดยมีความสูงประมาณ 1.079 และมีส่วนที่เป็นไหล่ (shoulder) ที่พอจะเห็นได้ที่ตำแหน่งประมาณ 400 nm แต่ถ้าหากว่าค่า c เพิ่มขึ้นเช่นเป็น 20 ดังรูปบนขวา จะเห็นเป็นพีคใหญ่พีคเดียวที่มีศูนย์กลางอยู่ที่ตำแหน่งประมาณ 382 nm และมีความสูงประมาณ 1.347 (มากกว่าที่ควรเป็นประมาณ 35%)

ส่วนรูปที่ ๓ (ล่าง) นั้นเป็นกรณีเดียวกับรูปที่ ๓ (บนขวา) เพียงแต่ลดค่า a ของพีคที่ตำแหน่ง 400 nm ลงเหลือ 0.2 ซึ่งก็พบว่าพีคสัญญาณรวมจะมีศูนย์กลางอยู่ที่ 382 nm และมีความสูงประมาณ 1.128
ต่อไปขอให้ลองพิจารณารูปที่ ๔ ดูก่อน ซึ่งเป็นกรณีผลรวมของพีคสองพีคที่มีค่า c เท่ากันคือ 20 แต่ค่า a ของพีคทั้งสองเปลี่ยนไปโดยที่ยังคงสัดส่วนของค่า a ของพีคที่ตำแหน่ง 380 และ 400 nm กล่าวคือให้ค่า a ของพีคที่ตำแหน่ง 400 nm มีค่าเพียง 60% ของค่า a ของพีคที่ตำแหน่ง 380 nm

รูปที่ ๔ พีครวมของสองพีคที่มีอัตราส่วนความสูงเท่ากัน (ซ้าย) พีคที่ 380 nm มี a = 1.00 ส่วนพีคที่ 400 nm มี a = 0.50 (ขวา) พีคที่ 380 nm มี a = 0.60 ส่วนพีคที่ 400 nm มี a = 0.30 โดยค่า c ของพีคในรูปทั้งสองเท่ากับ 20

ในกรณีที่ค่า a ของพีคที่ 380 nm มีค่าเท่ากับ 1.00 และของพีคที่ 400 nm มีค่าเท่ากับ 0.50 นั้น (รูปที่ ๔ ซ้าย) พบว่าพีครวมมียอดอยู่ที่ตำแหน่ง 386 nm และความสูง 1.347 หรือสูงกว่าความสูงของพีคที่ 380 nm อยู่ประมาณ 35% ส่วนกรณีที่ค่า a ของพีคที่ 380 nm มีค่าเท่ากับ 0.60 และของพีคที่ 400 nm มีค่าเท่ากับ 0.30 นั้น (รูปที่ ๔ ขวา) พบว่าตำแหน่งยอดของพีครวมยังคงอยู่ที่ 386 nm และความสูงเท่ากับ 0.808 หรือสูงกว่าความสูงของพีคที่ 380 nm อยู่ประมาณ 35% เช่นเดียวกัน

โครงสร้างโมเลกุลของสารอินทรีย์จากธรรมชาตินั้นมักจะมีโครงสร้างขนาดใหญ่และมีการดูดกลืนคลื่นแสงที่ความยาวคลื่นหลายตำแหน่ง แต่ในการวิเคราะห์นั้นมักจะใช้ความยาวคลื่นที่มีการดูดกลืนที่เด่นชัดมากที่สุด เช่นสมมุติว่าเรามีสารชนิดหนึ่งที่มีการดูดกลืนคลื่นแสงที่ความยาวคลื่น 380 nm และ 400 nm โดยการดูดกลืนที่ความยาวคลื่น 380 nm นั้นเด่นชัดกว่าที่ 400 nm (กรณีดังรูปที่ ๔) ในกรณีที่สารนี้มีความเข้มข้นแตกต่างกันไป ค่าการดูดกลืนที่ตำแหน่งความยาวคลื่นต่าง ๆ ก็จะเปลี่ยนแปลงไปด้วย โดยจะเปลี่ยนแปลงด้วยอัตราส่วนเดียวกัน ดังเช่นที่แสดงในรูปที่ ๔ ซึ่งเราอาจใช้ความสูงของพีคที่ความยาวคลื่น 380 nm (ต้องทำการ deconvolution สัญญาณที่ได้ก่อน) หรือความสูงของพีคสัญญาณรวม เป็นตัวระบุความเข้มข้นของสารตัวอย่างก็ได้

แต่ถ้าเป็นตัวอย่างที่ประกอบด้วยสารหลายชนิดปนกันอยู่นั้น พีคการดูดกลืนที่เกิดจากสารตัวอื่นที่ให้พีคการดูดกลืนในตำแหน่งที่ใกล้เคียงกับพีคการดูดกลืนของสารตัวอย่างที่เราต้องการวัดปริมาณ สามารถส่งผลกระทบต่อความสูงและตำแหน่งพีคการดูดกลืนของสารตัวอย่างที่เราต้องการวัดปริมาณได้ ตัวอย่างของกรณีนี้ได้แก่กรณีที่แสดงในรูปที่ ๓

สมมุติว่าสารที่เราต้องการวิเคราะห์นั้นให้พีคการดูดกลืนที่ความยาวคลื่น 380 nm แต่ในสารตัวอย่างของเรานั้นมีสารอื่นรวมอยู่ด้วยที่ให้พีคการดูดกลืนที่ความยาวคลื่น 400 nm กราฟในรูปที่ ๓ แสดงให้เห็นชัดว่าที่พีคการดูดกลืนที่ความยาวคลื่น 380 nm ที่มีขนาดคงที่ แต่ถ้าพีคการดูดกลืนที่ความยาวคลื่น 400 nm เปลี่ยนแปลงไป จะทำให้พีคผลรวมนั้นเปลี่ยนแปลงไปด้วย และการเปลี่ยนแปลงนั้นจะมากขึ้นถ้าหากพีคมีความกว้างมากขึ้น

กรณีที่แสดงในรูปที่ ๓ นั้นสามารถก่อปัญหาได้ถ้าผู้อ่านผลการทดลองคิดว่าพีคเส้นสีเขียวที่ได้มานั้นเป็นพีคการดูดกลืนที่ตำแหน่ง 380 nm เพียงพีคเดียว ทั้ง ๆ ที่ในความเป็นจริงนั้นพีคเส้นสีเขียวดังกล่าวเป็นพีครวมของการดูดกลืนที่ตำแหน่ง 380 nm (ที่เกิดจากสารที่เราต้องการวัด) และที่ตำแหน่ง 400 nm (ที่เกิดจากสารตัวอื่น) รวมกันอยู่ ดังนั้นถ้านำความสูงของพีคผลรวมที่ได้ไปแปลผลว่าเป็นของสัญญาณการดูดกลืนที่ความยาวคลื่น 380 nm เพียงพีคเดียวเท่านั้น ก็จะให้ผลที่ผิดพลาดไปจากความเป็นจริงได้มาก โดยจะทำให้อ่านค่าได้สูงกว่าความเป็นจริง (แต่บางคนอาจจะชอบ โดยเฉพาะเวลาที่ต้องการวัดปริมาณสารที่สกัดออกมาได้ เพราะมันทำให้ผลการทดลองดูดีขึ้น) แต่ถ้านำสัญญาณที่ได้นั้นไปทำการแยกพีค (deconvolution) ก่อน ก็จะเห็นผลการวัดที่แตกต่างออกไป คือจะเห็นว่าความสูงของพีคการดูดกลืนที่ความยาวคลื่น 380 nm นั้นเท่ากันหมด

ถึงตอนท้ายนี้คงมีคนสงสัยว่าพีคการดูดกลืนที่เราเคยวัดนั้นมีความกว้างเท่าใด ตัวอย่างผลการวิเคราะห์ที่เคยนำมาแสดงในรูปที่ ๒ ของ Memoir ฉบับที่ ๒๖๓ "UV-Vis - peak fitting" แสดงให้เห็นพีคที่ผ่านการ deconvolution แล้วมีค่า c ประมาณ 20 ซึ่งก็อยู่ในระดับเดียวกันกับตัวอย่างที่นำมาแสดงใน Memoir ฉบับที่ ๕๐๘ นี้