วันอาทิตย์ที่ 23 สิงหาคม พ.ศ. 2552

ทำความรู้จักกับ Chromatogram (ตอนที่ 1) MO Memoir : วันศุกร์ที่ ๓ มิถุนายน ๒๕๕๒

เนื้อหาในเรื่องนี้ใช้พื้นฐานคำนิยามโดยอ้างอิงจากเอกสาร MO Memoir 2552 Jan 24 Sat เรื่องศัพท์เทคนิค-เคมีวิเคราะห์

เครื่องแก๊สโครมาโทกราฟ (Gas chromatograph) หรือที่เรียกกันย่อ ๆ ว่า GC นั้นเป็นเครื่องมือหลักตัวหนึ่งที่ใช้ในงานวิจัย โดยใช้เพื่อแยกแยะและระบุองค์ประกอบของสารตัวอย่าง ผลที่รายงานออกมานั้นจะอยู่ในรูปของกราฟที่เรียกว่าโครมาโทแกรม (Chromatogram) แต่ถ้าใช้เครื่องอินทิเกรเตอร์ (Integrator) หรือในปัจจุบันซึ่งมีการใช้เครื่องไมโครคอมพิวเตอร์ ก็จะได้ข้อมูลตัวเลขที่เป็น เวลาที่เกิดจุดสูงสุดของแต่ละพีค (peak) พื้นที่ของแต่ละพีค และความสูงของแต่ละพีค ออกมาด้วย นอกจากนั้นก็ยังอาจมีข้อมูลอื่น ๆ (ขึ้นอยู่กับโปรแกรมคอมพิวเตอร์และความสามารถของอินทิเกรเตอร์แต่ละตัว) เช่น วิธีการลาก base line ในการคำนวณพื้นที่/ความสูงของแต่ละพีค ความเช้มข้นของสาร เป็นต้น

การระบุชนิดของสารจะดูได้จากเวลาที่เกิดจุดสูงสุดของแต่ละพีค และปริมาณสารจะหาได้จากพื้นที่หรือความสูงของพีคนั้น ๆ

ปัญหาหนึ่งที่พบเสมอเป็นประจำคือนิสิต (หรือตัวอาจารย์เองก็ตาม) มักจะรออ่านเฉพาะข้อมูลที่เป็นตัวเลข โดยไม่ได้ทำการศึกษาหรือให้ความสนใจใด ๆ เลยว่ามีปัจจัยใดบ้างในโปรแกรมหรือตัวเครื่อง ที่เป็นตัวกำหนดว่าข้อมูลตัวเลขที่เป็นไปตามเงื่อนไขใดจึงจะได้รับการแสดงผล หรือตัวเลขที่แสดงผลนั้นมีความถูกต้องตามความเป็นจริงหรือไม่

ความไม่สนใจในเรื่องเหล่านี้นำไปสู่การวิเคราะห์ข้อมูลที่ผิด โดยเฉพาะเรื่องการหาปริมาณที่ผิดพลาดและการมองไม่เห็นสารใดสารหนึ่งทั้ง ๆ ที่สารนั้นมีพีคปรากฏบนโครมาโทแกรม การรายงานสัญญาณรบกวนว่าเป็นพีค หรือการที่เห็นว่ามีรายงานว่ามีการเกิดพีคทั้ง ๆ ที่มองไม่เห็นพีคนั้นบนโครมาโทแกรม

จากประสบการณ์ที่พบมานั้น สัญญาณที่ส่งมาจากเครื่อง GC เมื่อเข้าสู่เครื่องอินทิเกรเตอร์หรือคอมพิวเตอร์แล้ว จะถูกแบ่งแยกออกเป็น 2 ส่วนดังนี้

สัญญาณส่วนที่หนึ่ง เป็นสัญญาณที่ใช้เพื่อการแสดงผล (อาจเป็นการเขียนกราฟลงบนกระดาษหรือวาดเป็นรูปบนหน้าจอคอมพิวเตอร์) สัญญาณส่วนนี้มักจะถูกปรับแต่งเพื่อให้เหมาะสมกับขนาดหน้ากระดาษหรือสเกลที่กำหนดไว้บนจอคอมพิวเตอร์ และ

สัญญาณส่วนที่สอง เป็นสัญญาณที่ใช้เพื่อการคำนวณพื้นที่และความสูงของพีค ส่วนเรื่องที่ว่าสัญญาณส่วนนี้จะมีความเกี่ยวข้องกับการปรับแต่งสัญญาณส่วนที่หนึ่งหรือไม่นั้น ขึ้นอยู่กับตัวชนิดและรุ่นของอุปกรณ์ที่ใช้งาน ซึ่งควรต้องทำการทดสอบก่อนเริ่มใช้งาน (ถ้ามีความเกี่ยวข้องคือเมื่อทำการปรับแต่งสัญญาณส่วนที่หนึ่ง สัญญาณส่วนที่สองจะถูกปรับแต่งตามไปด้วย แต่ถ้าไม่มีความเกี่ยวข้องคือการปรับแต่งใด ๆ ที่กระทำต่อสัญญาณส่วนที่หนึ่งจะไม่ส่งผลใด ๆ ต่อสัญญาณส่วนที่สอง)

การพิจารณาว่าเมื่อใดเกิดพีคนั้น ถ้าเป็นการใช้สายตาคนก็ไม่ยากอะไร ก็แค่ดูว่าเส้น base line มันไม่เรียบ มีการกระโดดขึ้นและตกลง แต่ถ้าต้องการให้อุปกรณ์อิเล็กทรอนิกส์นำสัญญาณดังกล่าวไปประมวลผล เราจำเป็นต้องแปลงสัญญาณที่เกิดขึ้นให้เราเห็นด้วยตาเปล่าให้เป็นสมการคณิตศาสตร์ให้ได้ก่อน

นับว่าเป็นโชคดีอย่างหนึ่งที่โครมาโทแกรมจากเครื่อง GC นั้นมักมีสัญญาณ base line ปรกติที่จัดได้ว่าราบเรียบเมื่อเทียบกับอุปกรณ์วัดชนิดอื่น ถ้านึกภาพไม่ออกว่า base line ที่ไม่ราบเรียบนั้นเป็นอย่างไร ก็ลองไปดูสัญญาณที่ได้จากเครื่อง XRD หรือ XPS เป็นตัวอย่าง base line ของโครมาโทแกรมอาจไม่ราบเรียบได้ถ้าพิจารณาจากสัญญาณที่มาจาก detector โดยตรงโดยไม่มีการหั่นสัญญาณ หรืออาจเกิดขึ้นจากการที่ detector หรือคอลัมน์สกปรก ทำให้มีสัญญาณของสิ่งปนเปื้อนส่งออกมาตลอดเวลา ซึ่งในกรณีดังกล่าวต้องมีการกรองสัญญาณ (อาจใช้ฮาร์ดแวร์หรือซอฟต์แวร์ก็ได้) เพื่อให้ได้สัญญาณที่ราบเรียบก่อน

ต่อไปจะกล่าวถึงเงื่อนไขของการเป็นพีคซึ่งมีอยู่ด้วยกัน 3 เงื่อนไขดังนี้ (เฉพาะกรณีที่อัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวน (Signal to noise ratio หรือ S/N มีค่ามากกว่า 2 ซึ่งโดยปรกติสัญญาณ GC ก็มักเป็นเช่นนี้อยู่แล้ว)

เงื่อนไขที่ 1 จุดเริ่มต้นพีค

คือจุดที่สัญญาณมีการเปลี่ยนแปลงค่าความชัน (Slope) แตกต่างไปจากความชันของ base line เกินกว่าค่าที่กำหนดไว้ (กรณีของพีคเดี่ยว ดูรูปที่ 1 ประกอบ) หรือสัญญาณมีการเปลี่ยนแปลงค่าความชันแตกต่างไปจากความชันแตกต่างไปจากค่าความชันเฉลี่ย ณ ขณะช่วงเวลาใด ๆ เกิดกว่าค่าที่กำหนด (กรณีของพีคเล็กซ้อนอยู่บนหางพีคใหญ่ หรือกรณีของพีคที่ปรากฏเป็นไหล่ (shoulder) อยู่บนพีคใหญ่ ดูรูปที่ 2 ประกอบ)


รูปที่ 1 การกำหนดจุดเริ่มต้นเกิดพีค เส้นประคือ base line ส่วนเส้นทึบสีแดงคือสัญญาณ การจะให้ระบุว่าเกิดพีคขึ้นหรือไม่ต้องกำหนดค่าต่ำสุดของมุมระหว่าง base line และสัญญาณให้เหมาะสม

รูปที่ 2 การซ้อนกันของพีคเล็กบนพีคใหญ่ ในกรณีที่เกิดขึ้นบริเวณส่วนหางของพีคใหญ่จะเห็นเป็นพีคเล็กปรากฏชัดเจน แต่ถ้าเป็นการซ้อนกันโดยมีจุดยอดของพีคอยู่ใกล้กันจะเห็นเป็นลักษณะเกิดเป็นไหล่ (shoulder) บนพีคใหญ่ เส้นประคือแนวสัญญาณของพีคใหญ่ที่ควรเป็น ส่วนเส้นสีแดงเป็นสัญญาณรวมของพีคใหญ่และพีคเล็ก

ความชันของ base line นั้นไม่จำเป็นต้องเป็น 0 (ศูนย์) อาจมีค่าเป็นบวกเล็กน้อย (วิ่งขึ้น) หรือติดลบเล็กน้อย (วิ่งลง) ก็ได้ แต่ต้องไม่น่าเกลียดจนเกินไป ส่วนตัวผมเองนั้นถ้าเปิดเครื่องไว้ทั้งวัน (8-12 ชั่วโมง) และพบว่า base line มีการย้ายตำแหน่งสูงขึ้นหรือต่ำลงไม่เกิน 2 cm ก็เรียกว่ายังพอรับได้ (ส่วนคนอื่นจะคิดยังไงผมก็ไม่รู้ สามารถคิดเป็นอย่างอื่นได้โดยไม่ต้องตามผมเสมอไป)

โดยปรกติก่อนที่จะเริ่มทำการวิเคราะห์นั้นเรามักคาดหวังว่า base line นิ่งแล้ว (คือมีความชันคงที่แล้ว) แต่ในทางปฏิบัตินั้น base line อาจยังไม่เข้าที่ ทั้งนี้อาจเป็นเพราะระบบยังไม่นิ่ง เช่นอุณหภูมิใน oven เข้าที่แล้วแต่อุณหภูมิในคอลัมน์ยังไม่เข้าที่ (ซึ่งมักเกิดขึ้นเมื่อเปิดเครื่องใหม่ ๆ หรือภายหลังการทำ temperature programme) หรือมีสารบางสารค่อย ๆ ออกมาจากคอลัมน์อย่างช้า ๆ ตลอดเวลา หรือบางครั้งอาจเกิดขึ้นระหว่างการวิเคราะห์ (ซึ่งมักเกิดในระหว่างการทำ temperature programme)

ดังนั้นเพื่อป้องกันไม่ให้เห็นปรากฏการณ์ดังกล่าวว่าเป็นการเกิดพีค จึงต้องมีการกำหนดค่าต่ำสุดของความแตกต่างระหว่างความชันของสัญญาณที่วัดได้ ณ เวลาใด ๆ กับความชันของ base line ที่กำหนดไว้ก่อนเริ่มการวิเคราะห์ ถ้ากำหนดค่าดังกล่าวไว้สูงเกินไปก็อาจทำให้มองไม่เห็นพีคขนาดเล็กที่เกิดขึ้นในช่วงท้าย ๆ ของโครมาโทแกรม แต่ถ้ากำหนดไว้น้อยเกินไปก็อาจทำให้อ่านการ drift ของสัญญาณเป็นพีคได้

เงื่อนไขที่ 2 จุดสูงสุดของพีค

คือจุดที่สัญญาณที่มีการเปลี่ยนแปลงนั้นเกิดการวกกลับ (จุดที่ค่าความชันเปลี่ยนจาก (+) ไปเป็น (0) และไป เป็น (-)) (กรณีของพีคเดี่ยว ดูรูปที่ 3 ประกอบ)

จุดนี้มักใช้เป็นตำแหน่งรายงานผลว่าเกิดพีคที่เวลาใด ในทางปฏิบัตินั้นตำแหน่งนี้เปลี่ยนแปลงได้เล็กน้อยขึ้นอยู่กับปริมาณสารที่ออกมาจากคอลัมน์ การที่ต้องกำหนดว่าต้องมีการเปลี่ยนค่าความชันเปลี่ยนจาก (+) ไปเป็น (0) และไป เป็น (-) ก็เพื่อป้องกันไม่ให้อ่านการเปลี่ยนระดับของ base line ว่าเป็นการเกิดพีค การเปลี่ยนระดับของ base line เป็นปรากฏการณ์ที่พบได้เสมอเวลาที่ทำ temperature programme และใช้ detector แบบ TCD ซึ่งอุณหภูมิการทำงานของคอลัมน์ที่เปลี่ยนไปจะส่งผลต่อตำแหน่งของ base line

รูปที่ 3 การมีอยู่ของจุดสูงสุดของพีค (รูปซ้าย) ในขณะที่รูปขวาเป็นการเปลี่ยนตำแหน่งของ base line

แต่วิธีการกำหนดแบบนี้ใช้ไม่ได้กับกรณีที่พีคมีการซ้อนกันและพีคเล็กปรากฏเป็นไหล่บนพีคใหญ่ (ดูรูปที่ 2) เพราะในกรณีดังกล่าวจะไม่มีการวกกลับของสัญญาณ โดยสัญญาณอาจมีเครื่องหมายความชันในทิศทางที่เป็น (+) หรือ (-) ตลอดโดยไม่มีการวกกลับ การระบุตำแหน่งของพีคดังกล่าวควรกระทำโดยการนำข้อมูลสัญญาณดังกล่าวมาทำการแยกพีค (ด้วยกระบวนการที่เรียกว่า deconvolution) ซึ่งในปัจจุบันมีซอฟต์แวร์อยู่หลายตัวที่สามารถจัดการกับสัญญาณดังกล่าวได้ (เช่น fityk ที่เราใช้กันอยู่)

เงื่อนไขที่ 3 จุดสิ้นสุดพีค

คือจุดความชันของสัญญาณมีการกลับเข้าหาค่าความชันของ base line โดยมีความแตกต่างไม่เกินไปจากค่าที่กำหนดไว้ (ในกรณีของพีคเดี่ยว) หรือความชันของสัญญาณกลับคืนสู่ค่าความชันก่อนเกิดพีคโดยมีความแตกต่างไม่เกินไปจากค่าที่กำหนดไว้ (ในกรณีของพีคเล็กซ้อนอยู่บนพีคใหญ่)

รูปที่ 4 (ซ้าย) พีคกลับมาสิ้นสุดที่ระดับ base line เดิม และ (ขวา) พีคไปสิ้นสุดที่ระดับ base line ใหม่

ในกรณีของพีคเดี่ยวนั้น การสิ้นสุดของพีคมักดูที่ความชันของสัญญาณเป็นหลัก ไม่ได้ดูที่ขนาดของสัญญาณ ดังนั้น ณ จุดสิ้นสุดของพีคนั้นตำแหน่งของ base line ไม่จำเป็นต้องอยู่ที่เดิม ตัวอย่างเช่นถ้าเรากำหนดให้พีคสิ้นสุดเมื่อความชันของสัญญาณวิ่งเข้าหาศูนย์ แต่ที่ตำแหน่งความชันของสัญญาณวิ่งเข้าหาศูนย์นั้นระดับสัญญาณอาจจะยังอยู่ ณ ตำแหน่งก่อนเริ่มเกิดพีค (รูปที่ 4 ด้านซ้าย) หรืออยู่คนละตำแหน่งก็ได้ (รูปที่ 4 ด้านขวา)

ในกรณีของพีคตั้งแต่ 2 พีคขึ้นไปที่แยกจากกันไม่สมบูรณ์นั้น จุดสิ้นสุดพีคจะขึ้นอยู่กับลักษณะของการเหลื่อมซ้อนและความฉลาดของซอร์ฟแวร์ที่ใช้ ในกรณีที่พีคตัวหลังมีขนาดที่ไม่เล็กเกินไปเมื่อเทียบกับพีคตัวแรกหรืออยู่ห่างจากพีคตัวแรกมาพอสมควร พีคตัวหลังก็จะแสดงลักษณะเป็นพีคที่ชัดเจนได้ดังแสดงในรูปที่ 5 ด้านซ้าย ในกรณีนี้ตัวโปรแกรมมักชอบระบุว่าตำแหน่งที่สัญญาณมีการวกกลับ (ลูกศรสีน้ำเงิน) เป็นตำแหน่งสิ้นสุดของพีคตัวแรก ทั้ง ๆ ที่ในความเป็นจริงไม่ใช่ตำแหน่งดังกล่าว ส่วนในกรณีที่พีคตัวหลังมีขนาดเล็กกว่าพีคตัวแรกและอยู่ห่างจากพีคตัวแรกไม่มาก พีคตัวหลังมักปรากฏเป็นไหล่ซึ่งไม่มีตำแหน่งยอด (รูปที่ 5 ด้านขวา) ลักษณะของพีคแบบนี้บางทีตัวโปรแกรมจะมองไม่เห็นและบอกว่ามีเพียงพีคเดียว โดยจะรวมพีคทั้งสองเข้าด้วยกันและรายงานเป็นพีคเดียว ซึ่งเป็นสิ่งที่ไม่ถูกต้อง


รูปที่ 5 ตัวอย่างพีค 2 พีคที่แยกจากกันไม่สมบูรณ์ ลูกศรสีน้ำเงินแสดงตำแหน่งที่ตัวโปรแกรมมักระบุว่าเป็นตำแหน่งสิ้นสุดของพีคแรก

ในอดีตนั้นพีคตามลักษณะที่แสดงในรูปที่ 5 จะก่อให้เกิดปัญหาเรื่องการระบุพื้นที่ใต้พีคหรือความสูงของพีคแต่ละพีค ทำให้เกิดวิธีการประมาณในรูปแบบต่าง ๆ ซึ่งยังคงตกค้างอยู่จนถึงปัจจุบันแม้ว่าในปัจจุบันจะมีคอมพิวเตอร์ความสามารถสูงและราคาถูกให้ใช้งาน แต่ในปัจจุบันนั้นเราสามารถทำการแยกพีคโดยใช้ซอร์ฟแวร์ช่วยได้ ทำให้สามารถระบุตำแหน่ง ความสูง และพื้นที่ของแต่ละพีคได้ถูกต้องมากขึ้น ซึ่งเทคนิคเดิมนั้นผมเห็นว่าไม่ควรจะนำมาใช้ถ้ามีคอมพิวเตอร์ให้ใช้

ขนาดและรูปร่างของพีคนั้นจะขึ้นอยู่กับชนิดคอลัมน์ที่ใช้และเวลาที่สารออกมาจากคอลัมน์ อาจกล่าวได้ว่าคอลัมน์ GC ที่ใช้กันอยู่ทั่วไปนั้นแบ่งออกได้เป็น 2 ประเภทคือ packed column และ capillary column ในกรณีของ packed column นั้นพีคที่ออกมาในช่วงแรกจะมีลักษณะที่แคบและสูงและมักไม่ค่อยมีการลากหาง (tailing) ส่วนพีคที่ออกมาในช่วงหลังจะมีลักษณะที่เตี้ยและกว้างและมักมีการลากหางที่ยาวกว่า ส่วน capillary column นั้นจะให้พีคที่มีลักษณะแคบและสูงไม่ว่าจะเป็นพีคที่ออกมาในช่วงแรกหรือช่วงหลังก็ตาม ส่วนสาเหตุที่ว่าทำไมคอลัมน์ทั้งสองจึงให้พีคที่มีลักษณะแตกต่างกันนั้นค่อยเอาไว้เล่าคราวหลัง

ไม่มีความคิดเห็น: