GC-2014 ECD & PDD ตอนที่ ๑๙ การคำนวณพื้นที่พีค NH3 (แก้ไข ๑) MO Memoir : Wednesday 29 February 2555

เนื้อหาในเอกสารฉบับนี้เป็นการบันทึกการประชุมย่อยเมื่อช่วงเช้าวันนี้ เรื่องปัญหาการหาพื้นที่พีค NH₃ จากเครื่อง GC-2014 ECD & PDD

๑. การปรับความปริมาณ NH₃ ที่ฉีดเข้าคอลัมน์ในการสร้าง calibration curve

๑.๑ "ปริมาณ" ในที่นี้คือผลคูณระหว่าง "ความเข้มข้น" กับ "ปริมาตร"

๑.๒ ในการสร้าง calibration curve นั้นเราต้องฉีดสารที่ทราบ "ปริมาณ" ที่แน่นอน ที่ "ปริมาณ" ต่าง ๆ กัน เพื่อหาความสัมพันธ์ระหว่างสัญญาณ (พื้นที่พีค) กับ "ปริมาณ" สารที่ฉีด

๑.๓ ในกรณีของเครื่อง GC-2014 ECD & PDD ที่เราใช้นั้น การปรับความปริมาณ NH₃ ที่ฉีดเข้าคอลัมน์ในการสร้าง calibration curve เราใช้วิธีการเปลี่ยน "ความเข้มข้น" ของ NH₃ ในแก๊ส และเปลี่ยน "ปริมาตร" ของ sampling loop

๑.๔ เรามี sampling loop อยู่สองขนาดคือ 0.1 ml และ 0.5 ml ที่ใช้ในการสร้าง calibration curve แต่ในการวิเคราะห์ตัวอย่างนั้นเราจะใช้ขนาด 0.5 ml เท่านั้น

๑.๕ เราสร้างจุดแรกของ calibration curve ได้โดยใช้แก๊ส NH₃ เข้มข้น 120 ppm และ sampling loop ขนาด 0.5 ml

๑.๖ จากนั้นเราสร้างจุดที่สองของ calibration curve ได้โดยยังคงใช้แก๊ส NH₃ เข้มข้น 120 ppm แต่เปลี่ยนขนาด sampling loop เป็นขนาด 0.1 ml ซึ่งการฉีดแก๊สเข้มข้น 120 ppm ปริมาตร 0.1 ml จะเทียบเท่ากับการฉีดแก๊สเข้มข้น 24 ppm ปริมาตร 0.5 ml

๑.๗ ในการสร้างจุดที่สามและจุดที่สี่นั้น เดิมผมแนะนำให้ทำซ้ำแบบข้อ ๑.๕ และ ๑.๖ แต่ให้ปรับความเข้มข้นของ NH₃ เป็น 80 ppm ซึ่งก็จะทำให้ได้จุดเทียบเท่ากับการฉีดแก๊สเข้มข้น 80 ppm ปริมาตร 0.5 ml และการฉีดแก๊สเข้มข้น 16 ppm ปริมาตร 0.5 ml

๑.๘ จากการตรวจสอบข้อมูลที่ได้จากการฉีดตามแบบข้อ ๑.๗ นั้น ผมสงสัยว่าข้อมูลอาจจะมีปัญหา และอาจต้องทำการตรวจสอบใหม่

๑.๙ ปัญหาที่ผมสงสัยคือในการปรับความเข้มข้น NH₃ เป็น 80 ppm นั้น เราจำเป็นต้องลดอัตราการไหลของ NH₃ ให้ต่ำลงไปอีก แต่การทำงานของ mass flow controller นั้นอาจจะควบคุมการไหลได้ไม่ดีในช่วงที่ใกล้ปิดเต็มที่หรือใกล้เปิดเต็มที่

๑.๑๐ mass flow controller ที่เราใช้กับ NH₃ นั้นควบคุมการไหลในช่วง 0-10 และเราได้เคยสร้าง calibration curve เอาไว้ในช่วง 1-5 ในการทดลองตามปรกติที่ความเข้มข้น NH₃ 120 นั้น เราตั้ง mass flow controller ไว้ที่ไม่ถึง 1.1 ซึ่งเรียกว่าอยู่ติดขอบเขตล่างสุดของ calibration curve ที่เราสร้าง และอาจอยู่ที่ขอบเขตล่างสุดที่ mass flow controller ยังคงทำงานได้ดี

๑.๑๑ ดังนั้นเมื่อเราลดอัตราการไหลของ NH₃ ลงเพื่อให้ได้ความเข้มข้น NH₃ 80 ppm เราต้องตั้งค่าที่ mass flow controller ให้ต่ำกว่า 1.0 ซึ่งทำให้ผมสงสัยว่าอาจจะมีปัญหาในการควบคุมอัตราการไหลได้

๑.๑๒ ดังนั้นเพื่อเป็นการทดสอบหรือหลีกเลี่ยงปัญหาดังกล่าว ผมจึงเสนอให้ใช้วิธีการปรับความเข้มข้นของ NH₃ ที่ฉีดแทน แต่ให้ใช้ sampling loop ขนาด 0.1 ml ในการฉีด

๑.๑๓ เช่นอาจปรับความเข้มข้นของ NH₃ ในแก๊สเป็น 240 ppm และฉีดด้วย sampling loop ขนาด 0.1 ml ซึ่งจะเทียบเท่ากับการฉีดแก๊ส NH₃ เข้มข้น 48 ppm ด้วย sampling loop ขนาด 0.5 ml

๑.๑๔ ในทำนองเดียวกันถ้าเราทำตามแบบข้อ ๑.๑๓ แต่เปลี่ยนความเข้มข้น NH₃ เป็น 360 ppm และฉีดด้วย sampling loop ขนาด 0.1 ml ซึ่งจะเทียบเท่ากับการฉีดแก๊ส NH₃ เข้มข้น 72 ppm ด้วย sampling loop ขนาด 0.5 ml ดังนั้นเราก็จะได้จุดข้อมูลเทียบเท่ากับการฉีด NH₃ ปริมาตร 0.5 ml ที่ความเข้มข้น NH₃ 4 จุดด้วยกันคือ 24 48 72 และ 120 ppm

๑.๑๕ เมื่อนำข้อมูลที่ได้จากข้อ ๑.๗ ไปเปรียบเทียบกับข้อมูลที่ได้ในข้อ ๑.๑๔ ก็น่าจะทำให้เราบอกได้ว่าจุดข้อมูล 16 และ 80 ppm นั้นมีปัญหาหรือไม่

๒. การคำนวณพื้นที่พีค NH₃ จากโครมาโทแกรม

บันทึกนี้เป็นการปรับเปลี่ยนวิธีการลากเส้น base line และการทำ peak fitting ทดแทนวิธีการที่ได้กล่าวไว้ใน Memoir ปีที่ ๔ ฉบับที่ ๔๐๗ วันพฤหัสบดีที่ ๒๓ กุมภาพันธ์ ๒๕๕๕ เรื่อง "GC-2014 ECD & PDD ตอนที่ ๑๘ การคำนวณพื้นที่พีค NH₃" โดยขอให้ทดลองใช้วิธีการที่จะกล่าวต่อไปนี้แทน

๒ก ตำแหน่งการลาก base line

๒.๑ ในช่วงสัปดาห์ที่ผ่านมา ด้วยการลากเส้น base line ตามวิธีการที่กล่าวในบันทึกฉบับที่ ๔๐๗ และทำ peak fitting พีค NH₃ นั้นพบว่าพีค NH₃ ที่ได้จากการทำ peak fitting จะสิ้นสุดที่เวลาประมาณ 2.45 นาที

๒.๒ ในกรณีที่ความเข้มข้น NH₃ ต่ำนั้น พบว่าการลากเส้น base line และการทำ peak fitting ตามวิธีการกล่าวในบันทึกฉบับที่ ๔๐๗ จะให้พื้นที่พีคของ NH₃ ค่อนข้างสูง

รูปที่ ๑ แนวลากเส้น base line ของพีค NH3 โดยเปลี่ยนตำแหน่งเวลาขอบเขตด้านขวาจากเดิมที่ 3.5 นาทีเป็น 2.45 นาทีตรงตำแหน่งลูกศรสีน้ำเงิน (โปรแกรมที่ใช้คือ fityk 0.9.8) ส่วนขอบเขตซ้ายยังคงอยู่ที่ตำแหน่งสัญญาณเริ่มวกกลับตรงลูกศรสีเขียว

๒.๓ ดังนั้นจึงขอปรับเปลี่ยนตำแหน่งจุดลากเส้น base line โดยที่ขอบเขตด้านขวาของพีค NH₃ ยังคงเป็นตำแหน่งที่สัญญาณเริ่มมีการวกกลับเหมือนเดิม แต่ขอบเขตด้านขวาให้เปลี่ยนเป็นตำแหน่งที่เวลา 2.45 นาที (รูปที่ ๑)

๒.๔ หลังจากที่ตัด base line เรียบร้อยแล้ว ให้เติมพีคที่ 1 เข้าไปก่อนด้วยคำสั่ง auto-add โดยใช้ฟังก์ชัน SplitGaussian จากนั้นกดปุ่ม Starting fitting 1 ครั้ง (รูปที่ ๒)

รูปที่ ๒ หลังการเติมพีคที่ 1 และกดปุ่ม Starting fitting 1 ครั้ง เส้นสีเหลืองคือสัญญาณรวม จุดสีเขียวคือข้อมูลดิบ พีคที่ใส่เข้าไปเป็นเส้นสีแดง แต่ในขณะนี้โดยเส้นสัญญาณรวม (เส้นสีเหลือง) ทับอยู่

๒.๕ เติมพีคที่ 2 ด้วยคำสั่ง auto-add โดยใช้ฟังก์ชัน SplitGaussian และกดปุ่ม Starting fitting 1 ครั้ง (รูปที่ ๓)

รูปที่ ๓ หลังการเติมพีคที่ 2 และกดปุ่ม Starting fitting 1 ครั้ง เส้นสีเหลืองคือสัญญาณรวม จุดสีเขียวคือข้อมูลดิบ เส้นสีแดงคือพีคแต่ละพีคที่เติมเข้าไป

๒.๖ เติมพีคที่ 3 ด้วยคำสั่ง auto-add โดยใช้ฟังก์ชัน SplitGaussian และกดปุ่ม Starting fitting 1 ครั้ง (รูปที่ ๔)

รูปที่ ๔ หลังการเติมพีคที่ 3 และกดปุ่ม Starting fitting 1 ครั้ง จะเห็นว่าบริเวณในกรอบสีส้มนั้นยังมีความแตกต่างจากข้อมูลดิบอยู่มาก

๒.๗ เติมพีคที่ 4 ด้วยคำสั่ง auto-add โดยใช้ฟังก์ชัน SplitGaussian และกดปุ่ม Starting fitting 1 ครั้ง (รูปที่ ๕)

รูปที่ ๕ หลังการเติมพีคที่ 4 และกดปุ่ม Starting fitting 1 ครั้ง ที่นี้จะเห็นว่าสัญญาณรวมในบริเวณกรอบสีส้มจะเข้าได้ดีกับข้อมูลดิบแล้ว

๒.๘ พีคที่ ๔ ที่เติมเข้าไปนี้ผมคิดว่าเป็นสัญญาณส่วนต้นของพีคที่อยู่ถัดจากพีค NH₃ โดยสังเกตจากการลดลงของช่วงหางพีค NH₃ ซึ่งมีลักษณะคล้ายกับจะโป่งนูนขึ้นเล็กน้อย ทำให้สงสัยว่าสัญญาณช่วงท้ายของโครมาโทแกรมช่วงที่เราตัดมานั้นเป็นสัญญาณช่วงท้ายของพีค NH₃ ที่ซ้อนทับอยู่กับสัญญาณช่วงต้นของพีคที่อยู่ถัดไป ดังนั้นในการทำ peak fitting จึงควรต้องทำการ fit peak เข้ากับสัญญาณรวมก่อน จากนั้นจึงตัดสัญญาณที่คิดว่าเป็นสัญญาณส่วนต้นของพีคที่อยู่ถัดไป (พีคที่ 4 ที่เติมเข้าไป) ออก

 

๒.๙ หลังจากที่ทำตามขั้นตอนในข้อ ๒.๗ แล้ว ให้ทำการลบพีคที่ 4 ออก จะได้ผลรวมสัญญาณของ 3 พีคแรก (เส้นกราฟสีเหลืองในรูปที่ ๖) ซึ่งผมเห็นว่าการลาดลงในช่วงเวลาตั้งแต่ 2.3 นาทีเป็นต้นไปของเส้นสีเหลือง (พีคที่ได้จากการทำ peak fitting) มีลักษณะที่เป็นธรรมชาติใกล้เคียงกับพีคปรกติที่ไม่ซ้อนทับกับพีคอื่น (ตามแนวเส้นประสีน้ำเงิน) มากกว่าพีคข้อมูลดิบ (จุดสีเขียวที่ลดลงตามแนวเส้นประสีเขียว)

๒.๑๐ พื้นที่พีค NH₃ คำนวณโดยเอาพื้นที่พีคย่อยทั้ง 3 มารวมกัน ซึ่งในตัวอย่างนี้คือ (132869 + 7927.33 + 12689.1 = 153485.43)

รูปที่ ๖ หลังการตัดพีคที่ 4 ออก

๓. การสร้าง calibration curve

๓.๑ เมื่อตอนเช้าผมได้กล่าวถึงข้อสงสัยของผมเอาไว้ว่า ที่ปริมาณ NH₃ เป็นศูนย์นั้น พื้นที่พีค NH₃ ที่ได้จาก GC นั้นจะเป็นศูนย์ด้วยหรือไม่

๓.๒ การที่ปริมาณ NH₃ เป็นศูนย์นั้นเกิดได้สองกรณี กรณีแรกเกิดจากการที่เราไม่ป้อน NH₃ เข้าระบบ ซึ่งในกรณีนี้ผมคิดว่าพื้นที่พีค NH₃ ที่ได้จาก GC ควรมีค่าเป็นศูนย์

๓.๓ กรณีที่สองเกิดจากการที่เราป้อน NH₃ เข้าระบบ และ NH₃ ถูกใช้ไปจนหมด ในกรณีนี้ถ้าหาก NH₃ ของเรานั้นมีสารปนเปื้อน (ซึ่งสารปนเปื้อนนั้นไม่ทำปฏิกิริยาและมาพร้อมกับ NH₃ ในถัง) และพีคสารปนเปื้อนดังกล่าวซ้อนทับกับพีค NH₃ เราก็อาจเป็นพื้นที่พีคไม่เป็นศูนย์ก็ได้ (คือสัญญาณจาก NH₃ หมดไป แต่สัญญาณจากสารปนเปื้อนยังคงอยู่)

๓.๔ แต่เท่าที่สังเกตจากการทำ peak fitting ที่ความเข้มข้นต่างกันนั้น ผมคิดว่าที่ปริมาณ NH₃ เป็นศูนย์นั้น พื้นที่พีค NH₃ ที่ได้จาก GC ควรจะเป็นศูนย์ด้วย

๓.๕ ในการทำ curve fitting ของกราฟระหว่างพื้นที่พีคกับความเข้มข้น NH₃ นั้น ไม่จำเป็นต้องเป็นกราฟเส้นตรง แต่ถ้าพิจารณาแล้วคิดว่าการใช้กราฟเส้นตรงที่ยังคับให้ผ่านจุดศูนย์ดูแล้วไม่เข้ากับข้อมูล ก็ให้ทดลองใช้ฟังก์ชัน polynomial อันดับ 2 ดูก็ได้ (โดยบังคับให้ผ่านจุดศูนย์)

เรื่องงานในฉบับนี้คงพอแค่นี้ก่อน แล้วค่อยว่ากันใหม่อีกที