ตรวจโครมาโทแกรม ก่อนอ่านต้วเลข (การทำวิทยานิพนธ์ภาคปฏิบัติ ตอนที่ ๘๖) MO Memoir : Thursday 1 December 2559

จากประสบการณ์ทำงานกับเครื่องแก๊สโครมาโทกราฟ (Shimadza รุ่นเลข 8 14 และ 2014) พบว่า แม้ว่าจะมีการนำเอาคอมพิวเตอร์มาใช้ในการควบคุมการทำงาน บันทึกสัญญาณ และคำนวณขนาด (พื้นที่และ/หรือความสูง) พีคที่ได้ แต่วิธีที่ซอร์ฟแวร์ของเครื่องใช้นั้นยังอิงอยู่บน "การตัดกระดาษแล้วนำไปชั่งน้ำหนัก"
  

ใช่ว่าเทคนิค "การตัดกระดาษแล้วนำไปชั่งน้ำหนัก" จะใช้ไม่ได้ อันที่จริงถ้าเป็นพีคที่แยกออกเป็นอิสระต่อกันมันจะไม่มีปัญหาใด ๆ ปัญหามันจะเกิดเมื่อมีพีคเหลื่อมซ้อนทับกัน โดยการเหลื่อมซ้อนนั้นอาจมาในรูปแบบ 
   

(ก) เพียงแค่ส่วนหน้าของพีคหลังเหลื่อมซ้อนกับส่วนหลังของพีคหน้า (โดยส่วนท้ายของพีคหลังไม่ซ้อนทับกับส่วนท้ายของพีคหน้า) หรือ 
   

(ข) พีคหลังทั้งพีควางตัวอยู่บนส่วนหางของพีคหน้า (มักจะเป็นกรณีที่พีคหน้ามีขนาดใหญ่มากเมื่อเทียบกับพีคหลัง หรือพีคหน้าทีการลากหางที่ยาวมาก)
  

การหาพื้นที่ของพีคแต่ละพีคที่เหลื่อมซ้อนทับกันนี้ด้วยเทคนิค "การตัดกระดาษแล้วนำไปชั่งน้ำหนัก" นั้น ถ้าเป็นกรณี (ก) ก็จะใช้การหาตำแหน่งจุดที่สัญญาณวกกลับ แล้วก็ลากเส้นจากจุดนั้นลงมาในแนวดิ่งจนมาตัด base line (รูปที่ ๑) ในกรณีนี้พื้นที่ส่วนหางของพีคแรกจะกลายมาเป็นพื้นที่ของพีคหลัง และพื้นที่ส่วนหน้าของพีคหลังจะกลายเป็นพื้นที่ของพีคแรก
  

แต่ถ้าเป็นในกรณี (ข) ก็จะใช้การสร้างเส้นสัมผัสโค้งเพื่อบ่งบอกแนวส่วนหางของพีคแรก และพื้นที่พีคที่อยู่เหนือเส้นสัมผัสนี้จะแทนพื้นที่พีคที่สอง โดยความสูงของพีคที่สองจะวัดจากจุดสูงสุดของพีคที่สองนั้น ดิ่งลงมาจนถึงแนวเส้นสัมผัสนี้ (รูปที่ ๒)
  

ปัญหามันมักเกิดขึ้นถ้าการแยกนั้นมันก้ำกึ่งอยู่ตรงเกณฑ์การแบ่งว่าการซ้อนของพีคเป็นรูปแบบ (ก) หรือรูปแบบ (ข) และปัญหานี้มันเกิดได้ถ้าหากว่าพีคหน้านั้นมีขนาดใหญ่กว่าพีคหลัง ดังเช่นพีคตัวอย่างในรูปที่ ๓ ที่นำมาแยกแต่ละพีคให้ดูในรูปที่ ๑ และ ๒ จะเห็นว่าอันที่จริงแล้วพีคที่สอง (ที่เวลา 1.3 นาที) นั้นไม่ได้มีขนาดที่แตกต่างกันมากเลย แต่ด้วยวิธีการลากเส้นแบ่งพีคที่แตกต่างกัน ทำให้ความสูงของพีคที่สองที่เครื่องอินทิเกรเตอร์คำนวณได้นั้นมีขนาดแตกต่างกันถึง 3 เท่า และพื้นที่ก็แตกต่างกันถึง 7 เท่า (ผลการวิเคราะห์ได้จากเครื่อง GC และอินทิเกรเตอร์ยี่ห้อ Shimadzu) โดยความแตกต่างในการแบ่งพีคนี้ตัวเครื่องเองก็ระบุเอาไว้แล้วในคอลัมน์ถัดไป (คอลัมน์ MK ที่มักจะมีเครื่องหมาย S V หรือ T ปรากฏเมื่อมีปัญหาเรื่องการแบ่งพีค ส่วนนิยามของ S V หรือ T คืออะไรนั้นต้องไปดูจากคู่มือเครื่อง)
  

อันที่จริงเครื่องอินทิเกรเตอร์ของ Shimadzu ที่แลปเราใช้นั้น หลังการประมวลผลพีคเสร็จแล้วมันยังไม่ลบข้อมูลสัญญาณทิ้ง เราสามารถตรวจสอบวิธีการแบ่งพีคที่เครื่องทำให้ว่าเป็นที่พึงพอใจหรือไม่ ถ้าเห็นว่าไม่ถูกต้องเราก็สามารถทำการกำหนดวิธีการแบ่งพีคและทำการประมวลผลใหม่ได้ เรื่องนี้ก็มีการกล่าวไว้ในคู่มือเครื่อง (ที่ไม่มีใครอ่านกัน) 
   

แต่วิธีการที่ดีกว่าในการหาพื้นที่พีคที่ซ้อนทับกันคือการนำเอาค่าตัวเลขสัญญาณที่วัดได้ไปทำการประมวลผลใหม่ด้วยซอร์ฟแวร์อื่น (ถ้าหากสามารถดึงค่าตัวเลขสัญญาณออกมาเป็น text file ได้) เช่นโปรแกรม fityk

ต้อนรับเดือนสุดท้ายของปีนี้ด้วยเรื่องเบา ๆ แค่นี้ก่อน ด้วยรูปที่นำมาจากม้วนโครมาโทแกรมที่มีคนนำมาวางทิ้งไว้บนโต๊ะทำงานผมในห้องแลป

รูปที่ ๑ การแบ่งพีคเพื่อคำนวณพื้นที่และความสูงของพีคในกรณี (ก)

รูปที่ ๒ การแบ่งพีคเพื่อคำนวณพื้นที่และความสูงของพีคในกรณี (ข)

รูปที่ ๓ โครมาโทแกรมที่มีปัญหา ลองพิจารณาพื้นที่และความสูงของพีคที่เวลา 1.31 นาที เทียบระหว่างรูปบนและรูปล่าง จะเห็นว่าแม้ว่าพีคในรูปล่างจะมีขนาดเล็กกว่า แต่ก็ไม่ได้มีความสูงเหลือเพียงแค่ 1 ใน 3 หรือมีพื้นที่เพียงแค่ 1 ใน 7 ของพีคในรูปบน เหมือนดังค่าที่เครื่องอินทิเกรเตอร์รายงาน

ผลกระทบของน้ำที่มีต่อการวัดคาร์บอนไดออกไซด์ ตอนที่ ๑ (การทำวิทยานิพนธ์ภาคปฏิบัติ ตอนที่ ๗๔) MO Memoir : Monday 23 November 2558

ในการวัดปริมาณแก๊สคาร์บอนไดออกไซด์ (CO₂) ด้วยเครื่องแก๊สโครมาโทกราฟและใช้คอลัมน์ molecular sieve 5A นั้น สิ่งหนึ่งที่เป็นที่ทราบคือถ้าหากตัวอย่างมีไอน้ำ (H₂O) ผสมอยู่ และอุณหภูมิของคอลัมน์ต่ำเกินไป ไอน้ำนั้นจะสะสมอยู่ในคอลัมน์ และถ้าสะสมไว้มากก็จะทำให้ความแรงของพีค CO₂ นั้นลดลงไปเรื่อย ๆ จนกระทั่งไม่ปรากฏได้ (ทั้ง ๆ ที่ฉีด CO₂ ในปริมาณเท่าเดิม)
  

ดังนั้นถ้า CO₂ เป็นสารตั้งต้นของปฏิกิริยา (เช่นในปฏิกิริยา dry reforming) ก็จะเห็น CO₂ ด้านขาออกต่ำกว่าที่ควรจะเป็น ก็จะทำให้หลงเข้าใจผิดได้ว่าได้ค่า conversion สูง ในทางกลับกันถ้าCO₂ เป็นผลิตภัณฑ์ของปฏิกิริยา (เช่นในปฏิกิริยา oxidation สารอินทรีย์) ก็จะทำให้แปลผลผิดได้ว่าได้ค่า conversion ต่ำกว่าที่ควรจะเป็น
  

ดังนั้นในกรณีที่ตัวอย่างนั้นมีน้ำปะปนอยู่ ก็ต้องปรับตั้งเครื่อง GC เพื่อให้มั่นใจว่าน้ำนั้นจะไม่ส่งผลกระทบต่อขนาดพื้นที่พีค CO₂ ที่วัดได้ อย่างน้อยก็ในช่วงเวลาที่ทำการวิเคราะห์ และควรต้องมีการ regenerate (ฟื้นคืนสภาพ) คอลัมน์เป็นระยะด้วย โดยไม่ต้องรอให้พีค CO₂ หายไปก่อน
  

รูปที่ ๑-๓ แสดงตัวอย่างการวิเคราะห์ปริมาณ CO₂ ที่ทางกลุ่มเราทำการทดลองในวันศุกร์ที่ ๑๙ พฤศจิกายนที่ผ่านมา โดยใช้เครื่องแก๊สโครมาโทกราฟ Shimadzu GC-8A ติดตั้ง Thermal Conductivity Detector (TCD) ตั้งอุณหภูมิ TCD ไว้ที่ 130ºC กระแส TCD ตั้งไว้ที่ 120 mA ส่วนอุณหภูมิคอลัมน์ตั้งไว้ที่ 210ºC อัตราการไหลของ He ที่ใช้เป็น carrier gas 40 ml/min ทั้งสองคอลัมน์ คอลัมน์ที่ใช้วิเคราะห์คือ molecular sieve 5A 60/80 mesh เส้นผ่านศูนย์กลาง 3 mm ยาว 6 ฟุต คอลัมน์อ้างอิงคือ UNIBEED C 60/80 mesh เส้นผ่านศูนย์กลาง 3 mm ยาว 6 ฟุต
  

เหตุการณ์เริ่มจากวันพฤหัสบดีที่ ๑๙ ที่ได้ทำการทดลองฉีดสารละลาย NaHCO₃ เข้มข้น 1 mol/l ปริมาตร 10 microlitre ในช่วงเช้า พบว่าได้พื้นที่พีคออกมาประมาณ 100000 หน่วย จากนั้นพบว่าเกิดปัญหาพื้นที่พีคมีการเปลี่ยนแปลงอย่างมาก และจากการตรวจสอบพบว่าปัญหาเกิดจากการมีฟองแก๊สเกิดขึ้นใน syringe (ที่เล่าไว้ใน Memoir ฉบับวันเสาร์ที่ ๒๑ พฤศจิกายน ๒๕๕๘ ที่ผ่านมา) และหลังจากปรับแก้ปัญหาฟองอากาศแล้ว พบว่าพื้นที่พีคที่ได้จากการฉีดสารตัวอย่างปริมาตรเดียวกันนั้นออกมาใกล้กัน แต่พื้นที่พีคที่ได้จากการวัดในช่วงบ่ายวันนั้นนั้น "ต่ำกว่า" ค่าที่วัดได้ในช่วงเช้าอยู่มาก (คือช่วงบ่ายพื้นที่จากระดับ 100000 เหลือประมาณ 370000 หรือเพียงแค่ 1 ใน 3 เท่านั้น)
  

หลังจากเปิดเครื่องทิ้งไว้ทั้งคืนโดยคงอุณหภูมิคอลัมน์ไว้ที่ 210ºC แล้วมาทำการทดลองใหม่ซ้ำเดิมในเช้าวันศุกร์พบว่าพื้นที่พีคที่ได้นั้นกลับมีค่ามากขึ้นไปเท่ากับค่าที่วัดได้ในช่วงเช้าวันพฤหัสบดี แต่เมื่อทำการฉีดสารตัวอย่างซ้ำปริมาตรเดิม (คือฉีด 5 microlitre 3 ครั้ง (รูปที่ ๑) ตามด้วย 3 microlitre 3 ครั้ง (รูปที่ ๒) และ 7 microlitre 3 ครั้ง (รูปที่ ๓) ส่วนเวลาที่ทำการฉีดสารตัวอย่างดูได้จากโครมาโทแกรม) พบว่าพื้นที่พีคที่ได้นั้นมีแนวโน้มลดต่ำลงเรื่อย ๆ ในขณะที่แนวเส้น base line นั้นมีแนวโน้มเคลื่อนต่ำลงอย่างช้า ๆ ตลอดเวลา
  

การแก้ปัญหาเบื้องต้นด้วยการเพิ่มอุณหภูมิคอลัมน์ขึ้นอีก 10ºC และลดปริมาตรตัวอย่างที่ฉีดลงเหลือระดับต่ำกว่า 1 microlitre ที่ได้กระทำไปเมื่อเย็นวันศุกร์ที่ผ่านมา ทำให้ดูเหมือนว่าจะสามารถแก้ไขปัญหาที่เกิดจากน้ำได้ แต่อย่างไรก็ตามก็ต้องรอผลการทดลองยืนยันที่จะต้องกระทำกันต่อไป

รูปที่ ๑ โครมาโทแกรมจากการฉีดสารละลาย NaHCO₃ 1 mol/l 5 microlitre

รูปที่ ๒ โครมาโทแกรมจากการฉีดสารละลาย NaHCO₃ 1 mol/l 3 microlitre
 

รูปที่ ๓ โครมาโทแกรมจากการฉีดสารละลาย NaHCO₃ 1 mol/l 7 microlitre

ทำความรู้จักกับ Chromatogram ตอนที่ ๖ MO Memoir : Saturday 17 January 2558

เมื่อวันพฤหัสบดีที่ ๑๕ ที่ผ่านมา ทางกลุ่มได้มีการฝึกการใช้เครื่องแก๊สโครมาโทกราฟ (Gas Chromatograph - GC)ให้กับสมาชิกปี ๑ (นิสิตป.โท จำนวน ๕ ราย) เครื่องที่ใช้คือ Shimadzu GC-8A ติดตั้งตัวตรวจวัดชนิด Flame Ionisation Detector (FID) และบันทึกผลด้วยเครื่องอินทิเกรเตอร์ Shimadzu CR-8A โดยให้ทดลองวัดปริมาณความเข้มข้นอิ่มตัวของโทลูอีน (Toluene C₆H₅-CH₃) ที่ละลายในน้ำ ในช่วงเช้าเริ่มจากการนำโทลูอีนบริสุทธิ์มาฉีดเพื่อหาตำแหน่งพีค (เวลาที่โทลูอีนออกมาจากคอลัมน์) จากนั้นก็ปล่อยให้ทดลองหาภาวะที่เหมาะสมในการตั้งเครื่อง GC และอินทิเกรเตอร์ (พวก Range, Attenuation) เพื่อให้ได้รูปพีคโทลูอีนที่มีขนาดที่เหมาะสมบนกระดาษ และสัญญาณจาก FID ไม่เกิดการอิ่มตัว จากนั้นในช่วงบ่ายก็เป็นการฝึกฝีมือในการฉีดตัวอย่างของสมาชิกกลุ่มแต่ละคน เพื่อทดสอบว่าด้วยการใช้อุปกรณ์ตัวเดียวกัน ตัวอย่างตัวเดียวกัน ผลการวิเคราะห์ที่ได้นั้นจะออกมาอย่างไร
 

ในตอนแรกก็พบว่าฝีมือการฉีดแต่ละรายนั้นเอาแน่เอานอนไม่ได้ (เรื่องปรกติของมือใหม่) ไม่ว่าคนเดิมจะทำการฉีดซ้ำหรือเปรียบเทียบผลการวัดระหว่างแต่ละคน แต่บ่ายวันนั้นมันก็มีอะไรที่น่าสนใจหลายอย่าง ตัวอย่างเช่นผลการทดลองฉีดตัวอย่าง ๓ ครั้งที่เอามาให้ดูในรูปที่ ๑ ในหน้าถัดไป พีคที่เวลา 2.2-2.3 นาทีคือพีคของโทลูอีน ส่วนพีคเล็ก ๆ ก่อนหน้าหน้า (ที่เวลาประมาณ 1.2-1.3 นาที) นั้นค่อยว่ากันต่อในฉบับหน้า (มันมีเรื่องของพีคนี้โดยเฉพาะว่ามันมาจากไหน) ตรงนี้อยากให้สังเกตตรงค่าพื้นที่พีคและความสูงที่เครื่องอินทิเกรเตอร์วัดได้ดังนี้

ครั้งที่ ๑ พื้นที่พีค 795880 ความสูง 18323

ครั้งที่ ๒ พื้นที่พีค 938411 ความสูง 18186

ครั้งที่ ๓ พื้นที่พีค 734722 ความสูง 18928

ปรกตินั้นเราชอบที่จะใช้พื้นที่พีคมากกว่าที่จะใช้ความสูงของพีคในการบ่งบอกปริมาณสาร เพราะถ้า carrier gas ไหลไม่นิ่ง จะทำให้รูปความสูงของพีคนั้นเปลี่ยนไปตามอัตราการไหลของ carrier gas กล่าวคือถ้าไหลเร็วก็จะได้พีคแคบและสูง ถ้าไหลช้าก็จะได้พีคที่เตี้ยและกว้าง แต่พื้นที่จะประมาณเดิม 
   

ในกรณีของตัวอย่างที่ยกมานั้น จะเห็นว่าพื้นที่ของการฉีดครั้งที่ ๒ นั้นมากกว่าพื้นที่ของการฉีดครั้งที่ ๓ อยู่ 1.28 เท่า (938411/734722) และพื้นที่ของการฉีดครั้งที่ ๑ นั้นมากกว่าพื้นที่ของการฉีดครั้งที่ ๓ อยู่ 1.08 เท่า (795882/734722) ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการฉีดครั้งที่ ๑ และ ๓ นั้นให้ผลที่ใกล้เคียงกัน แต่ถ้าพิจารณาความสูงแล้วจะพบว่าการฉีดครั้งที่ ๒ ที่ให้พื้นที่มากที่สุดนั้นกลับให้ค่าความสูงพีคที่น้อยที่สุด 
   

แต่ถ้าพิจารณาจากความสูงจะพบว่าความสูงของพีคของการฉีดครั้งที่ ๓ มากกว่าของการฉีดครั้งที่ ๒ อยู่ 1.04 เท่า (18928/18186) และความสูงของพีคของการฉีดครั้งที่ ๑ มากกว่าของการฉีดครั้งที่ ๒ อยู่ 1.01 เท่า (18323/18186) ซึ่งจะเห็นว่าพีคความสูงของการฉีดทั้ง ๓ ครั้งใกล้เคียงกันมาก และถ้าพิจารณาจากรูปร่างของพีคที่ได้แล้วจะเห็นว่าขนาดของพีคทั้งสามใกล้เคียงกันมาก

ด้วยเหตุนี้จึงทำให้เกิดคำถามว่าถ้าเช่นนั้นอะไรทำให้การคำนวณพื้นที่พีคของการฉีดครั้งที่ ๒ นั้นได้มากกว่าของการฉีดครั้งแรกกับครั้งที่ ๓ ถึง 20%
  

คำตอบของคำถามดังกล่าวอยู่ที่ผลที่เครื่องพิมพ์ออกมาคือช่อง MK (ย่อมากจา Marks หรือหมายเหตุ) ซึ่งจะเห็นว่าในกรณีของการฉีดครั้งที่ ๑ และ ๓ นั้นมีการพิมพ์สัญญลักษณ์ V ที่ตำแหน่งพีคประมาณ 1.25 และ 2.2-2.3 นาที ในขณะที่การฉีดครั้งที่ ๒ นั้นมีการพิมพ์สัญญลักษณ์ V ที่ตำแหน่งพีค2.2-2.3 นาทีเพียงที่เดียว
 

รูปที่ ๑ โครมาโทแกรมที่ได้มาจากการฉีดน้ำที่มีโทลูอีนละลายอยู่
    
รูปที่ ๒ และ ๓ ข้างล่างเป็นคำอธิบายความหมายของสัญญลักษณ์ที่ปรากฏในช่อง MK ผมนำมาจากคู่มือของเครื่องอินทิเกรเตอร์ Shimadzu CR-5A แต่ของเครื่อง CR-8A ก็เหมือนกัน

  

รูปที่ ๒ คำอธิบายความหมายของสัญญลักษณ์ต่าง ๆ ในช่อง MK ของรูปที่ ๑

รูปที่ ๓ สำหรับพีคที่เหลื่อมซ้อนกัน ด้วยค่า Drift ที่แตกต่างกันจะทำให้คำนวณพื้นที่พีคได้แตกต่างกันเนื่องจากมีการลาก base line ที่แตกต่างกัน

ขอให้พิจารณาวิธีการลาก base line ที่อยู่ในกรอบสีแดงของรูปที่ ๓ ในกรณีของการฉีดครั้งที ่๑ และ ๓ นั้นเครื่องอินทิเกรเตอร์ทำการลาก base line ตามแบบที่ (2) คือลากจากจุดเริ่มเกิดพีคแรกไปจนถึงจุดที่สัญญาณเกิดการวกกลับที่เป็นจุดที่เครื่องระบุว่าเป็นตำแหน่งเริ่มเกิดพีคที่สอง และใช้เส้นนี้เป็นฐานในการคำนวณพื้นที่พีคแรก และลากเส้นจากจุดที่สัญญาณเริ่มวกกลับไปจนถึงตำแหน่ง base line เดิมที่เป็นจุดที่พีคที่สองสิ้นสุด และใช้เส้นนี้เป็นฐานในการคำนวณพื้นที่พีคที่สอง ในขณะที่ในการฉีดครั้งที่ ๒ นั้นเครื่องทำการลาก base line ตามแบบที่ (1) กล่าวคือเริ่มจากจุดเริ่มต้นเกิดพีคแรกไปจนถึงจุดสิ้นสุดพีคที่สอง และลากเส้นในแนวดิ่งจากตำแหน่งสัญญาณเริ่มวกกลับลงมาตัด base line ที่ลากขึ้น และใช้เส้นนี้เป็นตัวแบ่งพื้นที่ที่จะใช้ในการคำนวณพื้นที่พีคแรกและพื้นที่พีคที่สอง
  

ซึ่งจะเห็นว่าถ้าลาก base line ตามแบบที่ (2) จะมีพื้นที่พีคหายไปส่วนหนึ่ง ในกรณีของการฉีดครั้งที่ ๑ และ ๓ ที่พื้นที่พีคที่สองหายไปมากก็เพราะตำแหน่งจุดสัญญาณเริ่มวกกลับนั้นอยู่ค่อนข้างสูงและตำแหน่งสิ้นสุดของพีคที่สองนั้นอยู่ห่างออกมาจากตำแหน่งจุดสัญญาณวกกลับค่อนข้างมาก จึงทำให้เห็นพื้นที่พีคที่สองจากการฉีดครั้งที่ ๑ และครั้งที่ ๓ นั้นน้อยกว่าที่ได้จากการฉีดครั้งที่ ๒ มาก
  

กรณีนี้เกิดค่าของคำสั่ง DRIFT (อัตราการเปลี่ยนแปลงสัญญาณที่ถือว่าสัญญาณกลับมาที่ base line แล้ว) ถ้าเกิดกรณีที่พีคซ้อนกันดังรูป ที่ DRIFT มีค่าต่ำนั้นเครื่องจะลากแนว base line ตามแบบที่ (1) แต่ถ้า DRIFT มีค่าสูงเครื่องจะลากแนว base line ตามแบบที่ (2) ในการทดลองเมื่อวันพฤหัสบดีที่ผ่านมานั้นได้กำหนดให้เครื่อง CR-8A เลือกค่า DRIFT อย่างอัตโนมัติ 
   

แต่จากตัวอย่างที่ยกมาให้นี้ไม่ได้หมายความว่าไม่ว่าในกรณีใดก็ควรจะต้องตั้งค่า DRIFT ไว้ต่ำ มันขึ้นอยู่กับรูปแบบการเหลื่อมซ้อนทับกันของพีค ซึ่งต้องพิจารณาเป็นกรณีไปว่าการเหลื่อมซ้อนทับกันของพีคนั้นเกิดที่ไหน ตัวคู่มือเองก็ระบุเอาไว้เช่นนั้นด้วย ด้วยเหตุนี้ตัวเครื่องอินทิเกรเตอร์จึงบันทึกข้อมูลเอาไว้เพื่อให้ผู้ใช้สามารถนำข้อมูลนั้นมาทำการคำนวณใหม่ได้
  

ปัญหาเช่นนี้เกิดขึ้นเป็นประจำ แต่เนื่องจากเครื่องอินทิเกรเตอร์ที่เราใช้มันจะเก็บข้อมูลได้เพียงแค่การวัดครั้งสุดท้ายเพียงครั้งเดียว พอทำการวัดครั้งต่อไปข้อมูลเก่าจะถูกลบทิ้ง และเวลาใช้นั้นเรามักต้องทำการวัดต่อเนื่องกันหลายครั้ง ทางผมจึงมักจะแนะนำให้บันทึกข้อมูลตัวเลขของโครมาโทแกรมลงแผ่นดิสก์เอาไว้ เพื่อนำมาประมวลผลใหม่ด้วยโปรแกรมสำหรับใช้แยกพีค (เช่น fityk ที่กลุ่มเราใช้เป็นประจำ) ที่ใช้หาพื้นที่พีคของแต่ละพีคที่เหลื่อมซ้อนทับกันได้ดีกว่า 
  

ในกรณีของตัวอย่างที่ยกมานี้โดยส่วนตัวแล้วผมเห็นว่าผลการวิเคราะห์ที่น่าเชื่อถือมากกว่าคือผลที่ได้จากการฉีดครั้งที่ ๒ ในขณะที่ผลที่ได้จากการฉีดครั้งที่ ๑ และ ๓ นั้นแม้ว่าจะได้ค่าใกล้เคียงกัน แต่ก็เป็นค่าที่มีความคลาดเคลื่อนสูงทั้งคู่

ตัวอย่างที่ยกมาในวันนี้เป็นการแสดงให้เห็นว่า เสียงข้างมากก็ใช่ว่าจะถูกต้องเสมอไป เพราะมันอาจเกิดจากการทำผิดซ้ำเดิม ๆ

แนวทางหัวข้อการทำวิทยานิพนธ์นิสิตรหัส ๕๕ (ตอนที่ ๒๘) MO Memoir 2557 Feb 26 Wed

เอกสารฉบับนี้แจกจ่ายเป็นการภายใน ไม่นำเนื้อหาลง blog

เนื้อหาในเอกสารฉบับนี้เป็นภาพสรุปโครมาโทแกรมการวัดการเกิด N₂O

MO ตอบคำถาม การแยกพีค GC ด้วยโปรแกรม fityk MO Memoir : Tuesday 20 August 2556

เรื่องมันเริ่มจากเมื่อประมาณสองสัปดาห์ที่แล้วมีอีเมล์มาปรึกษาเรื่องการแยกพีคไนโตรเจนกับออกซิเจน โดยเขาบอกว่าก่อนหน้านี้มันก็พอจะแยกกันได้บ้างแม้ว่าจะมีการเหลื่อมซ้อนกันอยู่ แต่อยู่ดี ๆ มันก็ไม่แยกเอาซะดื้อ ๆ โดยพีคออกมาเร็วขึ้น ตอนที่เขาอีเมล์มาถามนั้นผมก็ตอบกลับไปว่าอยากเห็นโครมาโทแกรมหน่อยว่าหน้าตามันเป็นอย่างไร และก็บอกให้แวะมาคุยที่ห้องทำงานผมก็ได้เพราะตึกก็อยู่ใกล้ ๆ กัน

ตรงที่ผมบอกว่าให้แวะมาคุยกันที่ห้องทำงานก็ได้เพราะตึกก็อยู่ใกล้ ๆ กัน ดูเหมือนจะทำเอาเขางงไปเหมือนกันว่าผมรู้ได้อย่างไรว่าเขาเป็นใคร อยู่ที่ไหน วันที่เขาแวะมาหาเขาก็ถามผมเรื่องนี้ ผมก็เลยบอกเขาไปว่าก็เอาอีเมล์ของคุณใส่ลงไปใน google แล้วมันก็ขึ้นมาว่าคุณเคยไปโพสอะไรไว้ที่ไหนบ้าง หรือใช้อีเมล์นี้เปิด facebook หรือไม่

ก่อนหน้านี้ผมได้ตอบเขาไปว่าไนโตรเจนและออกซิเจนเป็นคู่หนึ่งที่แยกยาก เพราะขนาดโมเลกุลใกล้กันและจุดเดือดก็ใกล้กัน คอลัมน์บางชนิดแยก "อากาศ" ออกจากแก๊สตัวอื่น เช่น CO CO₂ และ Ar ได้ แต่ไม่แยก N₂ และ O₂ ที่เคยเห็นในแคตตาล็อกขายคอลัมน์ GC บางคอลัมน์ที่เขาบอกว่าแยกได้นั้นจะกระทำที่อุณหภูมิไม่สูง เช่นประมาณ 20 หรือ 25ºC ซึ่งในบ้านเราแล้วอุณหภูมินี้มันต่ำกว่าอุณหภูมิห้องอีก ถ้าจะนำเอาคอลัมน์แบบนี้มาใช้ก็ต้องเพิ่มความยาวให้มากกว่าที่เขาระบุไว้ในแคตตาล็อก หรือไม่ก็หาทางทำให้เครื่อง GC นั้นทำให้คอลัมน์มีอุณหภูมิต่ำกว่าอุณหภูมิห้องให้ได้ คอลัมน์ที่เขาใช้คือ micropacked 13X Molecular sieve 80/100 2m 1.00 I.D. วิเคราะห์ที่ 28ºC ซึ่งตรงนี้เขาบอกว่าเขาทำแลปในห้องแอร์ที่แอร์เย็น เครื่อง GC ก็เลยทำงานที่อุณหภูมินี้ได้

อีกอันหนึ่งที่แนะนำเขาไปคือให้ลองปรับ carrier gas flow rate ให้ต่ำลง แต่ถ้าทำแบบนี้กับ TCD ก็ต้องไปทำ calibration curve ใหม่ด้วย

หลังจากพบกันแล้วเขาก็ไปทดลองปรับอัตราการไหลของ carrier gas ให้ลดลง ซึ่งก็ทำให้เวลาที่พีคออกมานั้นออกมาที่เวลาเดิมก่อนมีปัญหา แต่ก็ยังมีการเหลื่อมซ้อนกันอยู่ดี จนกระทั่งวันศุกร์ที่แล้วก็ได้ส่งรูปพีคและไฟล์ .txt และ .csv มาให้ ผมเห็นรูปพีคของเขาแล้ว (ดูรูปที่ ๑) ก็เห็นว่าไม่น่าจะมีปัญหาอะไรมากในการใช้โปรแกรม fityk ในการแยกพีค (ถ้าใช้โปรแกรมเป็นแล้วนะ) พีคทั้งสองนั้นวางตัวอยู่บน base line ที่ค่อนข้างจะวางตัวราบ (แทบไม่มีการเฉียงขึ้นหรือลง) ไม่มีการปรากฏของพีคอื่นข้างเคียง ก็เลยเอาข้อมูลของเขามาทำการแยกพีคด้วยโปรแกรม fityk เล่นดู

อันที่จริงวิธีการทำ peak fitting นั้นทำได้หลายรูปแบบ ในกรณีที่พีคออกมาค่อนข้างจะชัดเจนนั้นเราสามารถให้โปรแกรมทำการเติมฟังก์ชันลงไปที่แต่ละพีคและทำ peak fitting ได้เลย แต่ในกรณีที่พีคมีการเหลื่อมซ้อนกันนั้น เท่าที่พบนั้นบางครั้งเราก็สามารถให้โปรแกรมทำการวางตำแหน่งพีคสำหรับพีคย่อยแต่ละพีคลงไปก่อน แล้วค่อยทำ peak fitting ทีเดียว แต่บ่อยครั้งเหมือนกัน โดยเฉพาะกรณีที่พีคเล็กมีจุดเริ่มต้นและจุดสิ้นสุดอยู่บนหางพีคใหญ่หรือซ้อนกับพีคใหญ่อยู่มาก จำเป็นต้องทำ peak fitting ทีละพีค โดยเลือกเอาเฉพาะข้อมูลส่วนที่คิดว่าเป็นของพีคใดพีคหนึ่งเท่านั้นมาทำ peak fitting ก่อน จากนั้นจึงทำการตรึงพีคที่ได้ แล้วจึงทำ peak fitting ส่วนที่เหลือ

จากข้อมูลที่เขาให้ผมมาในรูปที่ ๑ นั้น ผมลองทำการเติมพีคและทำ peak fitting โดยตรงโดยไม่ต้องไปยุ่งอะไรกับข้อมูลเดิมก็พบว่ามันทำได้ แต่ที่จะเอามาเล่าให้ฟังในบันทึกนี้ผมจะใช้วิธีแยกทำ peak fitting ทีละพีค เนื่องจากผมไม่ต้องการย่อรูปให้เล็กลง ดังนั้นคำบรรยายรูปจะแยกออกจากรูปแต่ละรูป
  

รูปที่ ๑ เป็นไฟล์ข้อมูลที่ผมได้รับมาในรูปไฟล์ .csv และนำมาเปิดด้วยโปรแกรม fityk ลักษณะเป็นพีคเล็กนำหน้าพีคใหญ่ โดยส่วนหางของพีคเล็กนั้นซ้อนทับอยู่กับส่วนหน้าของพีคใหญ่

รูปที่ ๑ โครมาโทแกรมที่ได้รับมา เมื่อเปิดด้วยโปรแกรม fityk

รูปที่ ๒ เป็นภาพขยายบริเวณส่วนฐานของพีค จะเห็นว่าในความเป็นจริงเส้น base line มีการเคลื่อนตัวไต่ขึ้นอย่างช้า ๆ โดยข้อมูลส่วนหน้านั้นติดลบเล็กน้อย ส่วนข้อมูลส่วนหลังนั้นมีค่าเป็นบวก
  

เนื่องจากฟังก์ชันที่เราใช้ในการทำ peak fitting นั้นเป็นฟังก์ชันที่มีค่าเป็นบวกเสมอ (เรามักใช้ฟังก์ชันที่โปรแกรม fityk เรียกว่า "SplitGaussian" ซึ่งเป็นฟังก์ชัน Gaussian ที่ไม่สมมาตรนั่นเอง) ถ้าหากข้อมูลที่นำมาทำ peak fitting นั้นมีค่าติดลบ จะทำให้โปรแกรมทำการเติมพีคที่ "กลับหัว" เข้าไป วิธีการป้องกันคือทำการ "ยก" ข้อมูลในมีค่าเป็นบวกทั้งหมดก่อน แต่ในขณะเดียวกันนั้นฟังก์ชันที่เราใช้นั้นจะลู่เข้าหาศูนย์ แต่ไม่ตัดกัน x ดังนั้นการตัด base line จึงควรให้บริเวณที่ใกล้กับฐานของพีคนั้นมากกว่าศูนย์เล็กน้อย แต่อย่ามากเกินไป เพราะจะทำให้โปรแกรมทำการเติมพีคที่มีความสูงน้อย แต่ความกว้างมากเข้ามา พีคนี้จะเป็นพีคตัวแทนของเส้น base line

ในรูปที่ ๒ ผมจึงตัดโดยตามแนวเส้นสีแดงที่แสดงในรูป (ใช้ปุ่มวางเส้น base line ในการวางแนวเส้น base line)

รูปที่ ๒ ภาพขยายโครมาโทแกรมในรูปที่ ๑ บริเวณเส้น base line และแนวการตัดเส้น base line (เส้นสีแดง)

รูปที่ ๓ เป็นรูปหลังจากตัดเส้น base line แล้ว รูปนี้เป็นการเลือกจุดข้อมูลที่คาดว่าเป็นเฉพาะของพีคแรกเท่านั้น โดยการกดปุ่มที่ลูกศร (1) ชี้ จากนั้นใช้เมาส์กำหนดจุด การทำให้จุดข้อมูลที่ไม่ต้องการเป็นจุด inactive ทำโดยการกดปุ่มด้านขวาของเมาส์ค้างไว้แล้วลากเมาส์ไปตามจุดข้อมูลเหล่านั้น จุดข้อมูลที่เป็น inactive จะกลายเป็นจุดสีเทา ในที่นี้ผมทำให้จุดข้อมูลช่วงเวลาประมาณก่อน 2.00 นาทีและหลัง 2.75 นาทีเป็นจุดที่ inactive จุดก่อนเวลา 2.00 นาทีเป็นช่วงที่ยังไม่มีพีคปรากฏ ส่วนช่วงเวลาถัดจ่าก 2.75 นาทีนั้นเป็นจุดข้อมูลที่เป็นผลรวมระหว่างส่วนท้ายของพีคเล็กและส่วนหน้าของพีคใหญ่ ในขณะที่จุดข้อมูลในช่วงเวลา 2.00 - 2.75 นาทีนั้นประมาณว่าเป็นของพีคเล็กเท่านั้น

รูปที่ ๓ การเลือกจุดข้อมูลที่คาดว่าเป็นของเฉพาะพีคแรก (ในกรอบสีแดง) เพื่อทำการสร้างพีคแรกขึ้นมาก่อน

รูปที่ ๔ เป็นการทำ peak fitting ของพีคแรก โดยเลือกฟังก์ชันที่นำมาใช้ในการทำ peak fitting จากช่องตรงลูกศร 1 ชี้ การเลือกฟังก์ชันนั้นต้องเหมาะสมกับชนิดของพีค ในกรณีของโครมโทแกรมนั้นเนื่องจากพีคมักจะไม่สมมาตร จึงเลือกใช้ฟังก์ชันที่โปรแกรม fityk เรียกว่า SplitGaussian ซึ่งอันทีจริงก็คือฟังก์ชัน Gaussian นั่นเอง แต่เป็นฟังก์ชันที่มีความกว้างด้านซ้ายและด้านขวาแตกต่างกัน (ถ้าเท่ากันมันก็จะเป็นฟังก์ชัน Gaussian)

จากนั้นก็ให้โปรแกรมวางตำแหน่งพีคให้ด้วยการกดที่ icon ที่ลูกศร 2 ชี้ ถ้าพบว่าตำแหน่งและ/หรือรูปร่างพีคที่โปรแกรมวางให้นั้นไม่ถูกใจเรา เรายังสามารถปรับแต่งรูปร่างของพีคที่โปรแกรมวางให้ด้วยการใช้เมาส์ไปปรับที่ตัวพีคโดยตรงได้ การวางพีคนี้ต้องดูรูปร่างพีคเป็นหลัก บางครั้งวางพีคเดียวก็พอ แต่บางครั้งก็ต้องวางหลาย ๆ พีคหน่อย ตรงนี้ต้องทดลองทำเอาเอง อย่างเช่นในทีนี้พบว่าวางเพียงพีคเดียวก็พอแล้ว ก็ไปกด icon ที่ลูกศร 3 ชี้เพื่อให้โปรแกรมทำ peak fitting การกด icon นี้สามารถกดได้หลายครั้งจนกว่าจะพบว่ามันเข้าที่ ในที่นี้จะได้พีคที่เป็นเส้นสีน้ำเงิน และมีรายละเอียดตำแหน่งพีคปรากฏในแทป function ตรงลูกศร 4 ชี้ ส่วนรายละเอียดของพีคเช่นข้อมูลพารามิเตอร์ พื้นที่ ความสูง จะอยู่ข้างล่างตรงกรอบสีแดงที่ลูกศร 5 ชี้

เมื่อได้รูปร่างพีคแรกแล้วก็ทำการตรึงพีคนี้ไว้ เพื่อไม่ให้เกิดการเปลี่ยนแปลงใด ๆ ในการทำ peak fitting ให้กับพีคที่สอง การตรึงพีคนั้นทำได้โดยการไปกดเลือกพีคที่ต้องการตรึง (ในกรอบที่ลูกศร 4 ชี้) จากนั้นไปกดที่ icon ที่เป็นรูปแม่กุญแจข้างล่าง (ตรงกรอบสีน้ำเงินที่ลูกศร 6 ชี้) ทุกตัว มันจะเปลี่ยนจากเปิดอ้างอยู่เป็นล็อค การทำเช่นนี้จะทำให้พีคที่ทำการล็อกเอาไว้แล้วถูกตรึงเอาไว้ ไม่เกิดการเปลี่ยนแปลงใด ๆ ในการทำ peak fitting ในขั้นตอนถัดไป
 

รูปที่ ๔ การทำ peak fitting ของพีคแรก

รูปที่ ๕ เป็นการทำ peak fitting ให้กับพีคที่สอง เนื่องจากพีคนี้ค่อนข้างใหญ่ทำให้บ่อยครั้งการใช้ peak เพียงพีคเดียวไม่สามารถที่จะปรับเข้ากับข้อมูลดิบได้หมด จึงมักต้องทำการเติมเข้าไปหลายพีค การเติมเข้าไปหลายพีคนั้นทำได้หลายแบบ เช่นอาจเพิ่มพีคเข้าไปจำนวนหนึ่งก่อนจนเห็นว่ามันใกล้เคียงข้อมูลดิบ จากนั้นจึงค่อยกดไอคอนให้โปรแกรมเริ่มกระบวนการ peak fitting หรืออาจทำการเติมพีคเข้าไปก่อนหนึ่งพีค กดไอคอนให้โปรแกรมทำ peak fitting แล้วจึงค่อยเพิ่มพีคที่สอง กดไอคอนให้โปรแกรมทำ peak fitting ถ้าเห็นว่าผลที่ออกมายังไม่ดีก็เพิ่มพีคที่สามและทำเช่นนี้ต่อไปเรื่อย ๆ ตรงจุดนี้ต้องลองดูกับข้อมูลของตัวเอง แม้แต่ข้อมูลเดียวกันถ้าตัดเส้น base line ต่างกันก็อาจทำให้กระบวนการ peak fitting เพื่อให้พีครวมออกมาดูดีนั้นแตกต่างกันไปได้ แต่ถ้าคำนวณพื้นที่รวมของทุกพีคแล้วมักจะเห็นว่าพอ ๆ กัน
 

ในกรณีของพีคที่สองในรูปที่ ๕ นั้น ผมใช้การเติมเข้าไปทีละพีคและทำ peak fitting จากนั้นจึงค่อยเติมพีคที่สองและทำ peak fitting จากนั้นจึงเติมพีคที่สามและทำ peak fitting ก็พบว่าพีครวมที่ได้ปรับเข้ากับข้อมูลดิบได้ดี ดังนั้นพื้นที่พีคของพีคหลังจะคำนวณได้จากผลรวมของพื้นที่พีคที่เวลา 3.08811 นาที 3.15324 นาที และ 3.21724 นาที พึงสังเกตว่าแม้ว่าจะมีต้องใช้พีคถึงสามพีค แต่ตำแหน่งยอดพีคของทั้งสามพีคนั้นอยู่ประมาณเวลาเดียวกัน อันนี้เป็นไปได้ว่าแต่ละพีคนั้นเป็นตัวแทนของการคายออกมาจากอนุภาค (packing material ที่อยู่ในคอลัมน์) ที่มีขนาดต่าง ๆ กัน

รูปที่ ๕ การทำ peak fitting พีคที่สอง

เมื่อได้พีคที่สองแล้วก็ควรทำการตรวจสอบด้วยว่าการทำ peak fitting นั้นยอมรับได้หรือไม่ สิ่งที่ผมทำเป็นปรกติก็คือทำการลบพีคแรกทิ้งแล้วดูว่าผลรวมของฟังก์ชันที่ใช้ในการประมาณค่าพีคที่สองนั้นเข้ากับข้อมูลดิบหรือไม่ รูปที่ ๖ เป็นรูปที่ได้ลบฟังก์ชันของพีคแรกทิ้งไป เส้นสีน้ำเงินคือเส้นผลรวมของพีค 3 พีคที่ใช้ในการประมาณค่าพีคที่สอง ซึ่งก็พบว่าปรับเข้ากับข้อมูลดิบได้ดี
 

รูปที่ ๖ รูปร่างของพีคที่สองเมื่อทำการลบพื้นที่หนึ่งทิ้งไป

 

เนื่องจากขนาด packing material ใน packed column นั้นไม่ได้มีขนาดเท่ากันทุกอนุภาค แต่มีการกระจายตัวของขนาดอนุภาคอยู่ สารที่ถูกดูดซับเอาไว้ในรูพรุนของอนุภาคขนาดเล็กจะหลุดออกมาได้ง่ายกว่าสารที่ถูกดูดซับเอาไว้ในรูพรุนของอนุภาคขนาดใหญ่ เพราะรูพรุนของอนุภาคขนาดเล็กนั้นมีเส้นทางที่สั้นกว่าทำให้ใช้เวลาน้อยกว่าในการแพร่จากข้างในรูพรุนออกมายัง carrier gas ส่วนที่ทำให้พีคเกิดการลากหางจึงเป็นส่วนของสารที่หลุดออกมาจากรูพรุนของอนุภาคขนาดใหญ่ ด้วยเหตุนี้พีคที่ได้นั้นจึงมีลักษณะที่ไม่สมมาตร การใช้ฟังก์ชันที่สมมาตรเช่น Gaussian จะใช้ทำให้ต้องใช้พีคประมาณค่าจำนวนมากจึงจะปรับพีครวมให้เข้ากับข้อมูลดิบได้ การใช้ฟังก์ชัน Gaussian เช่นฟังก์ชันที่เรียกว่า SplitGaussian ของโปรแกรม fityk จะทำให้ใช้พีคประมาณค่าจำนวนน้อยกว่า และปรับเข้ากับข้อมูลดิบได้ดีกว่า

ที่เขียนมาทั้งหมดนั้นเป็นแค่แนวทางหนึ่งในการทำ peak fitting ให้กับโครมาโทแกรมเท่านั้นเอง ไม่ได้หมายความว่าต้องปฏิบัติตามที่เขียนมาข้างต้นเสมอไป สิ่งที่ผู้ปฏิบัติควรทำก็คือปรับวิธีการให้เหมาะสมกับข้อมูลของตนเองและควรอธิบายได้ว่าทำไมจึงต้องทำเช่นนั้น

MO ตอบคำถาม สารพัดปัญหาโครมาโทแกรม MO Memoir : Sunday 4 August 2556

ช่วงสัปดาห์สุดท้ายของเดือนที่แล้ว มีอีเมล์จากผู้อ่านสองรายเขียนเข้ามาถามเรื่องปัญหา GC ซึ่งถ้าทางผมพอจะให้ความช่วยเหลือได้ก็จะตอบกลับไป แต่ส่วนใหญ่จะให้ได้แค่คำแนะนำว่าควรต้องตรวจสอบอะไรบ้าง เพราะบางทีคำถามมันก็กว้างเหลือเกิน (ไม่มีข้อมูลประกอบ) เหมือนกับคนไข้บอกกับหมอว่ามีอาการปวดหัวกับตัวร้อน แล้วถามว่าเป็นโรคอะไร 

 

แต่การตอบคำถามเช่นนี้บางทีมันก็สนุกดีเหมือนกัน (ผมเจอเป็นประจำ) เพราะมันเหมือนกับการฝึกให้เรามองความเป็นไปได้ทั้งหมดให้ได้ก่อนเพื่อตั้งสมมุติฐาน จากนั้นจึงค่อยควานหาข้อมูลเพิ่มเติมว่าสมมุติฐานข้อไหนมันไม่น่าจะเป็น ข้อไหนยังมีความเป็นไปได้อยู่ ก็เลยขอเอาเรื่องราวเหล่านี้มาเล่าสู่กันฟัง

เริ่มจากรายแรกก่อน ฉบับแรกส่งมาเมื่อวันพุธที่ ๒๔ กรกฎาคม ๒๕๕๖

สวัสดีค่ะ

ดิฉันเป็นนักศึกษาที่ใช้เครื่อง GC-FID (อยู่คนละมหาลัยกับอาจารย์ค่ะ)

รบกวนขอคำปรึกษาเรื่องพีคประหลาดที่อาจารย์ได้เขียนลงในบล๊อคเมื่อไม่นานมานี้ ดิฉันพบปัญหาเช่นเดียวกันค่ะ คือมีพีคประหลาดเล็ก ๆ ขึ้นเป็นระยะ ๆ

แต่ของดิฉัน บางครั้งขึ้นที่ช่วงอุณหภูมิสูง บางครั้งขึ้นตั้งแต่อุณหภูมิต่ำเลย แต่บางครั้งก็ไม่ขึ้นเลย กรณีนี้ฉีด solvent อย่างเดียวเลยนะคะ

เคยสงสัยว่าเป็นที่ septum แต่ลองลดอุณหภูมิ injector ลงพีคก็ยังไม่หายค่ะ

ไม่ทราบว่าอาจารย์พอมีคำแนะนำแก้ไขปัญหานี้ไหมคะ

ขอบพระคุณมากค่ะ

คำถามอย่างนี้ตอบยากที่ตรงที่ไม่มีรูปพีคมาให้ดู เพราะรูปทรงของพีคพอจะบอกอะไรได้บ้าง ทั้งพีคที่ออกมาที่อุณหภูมิสูงและอุณหภูมิต่ำ

คำตอบที่ให้ตรงนี้ต้องระวังถ้าจะนำไปใช้กับระบบที่ detector นั้นตอบสนองต่อการเปลี่ยนแปลงอัตราการไหลของ carrier gas เช่นพวก ECD และ FPD ที่เราเจอมา เพราะเมื่อวาล์วฉีดตัวอย่างหรือ switching valve เปลี่ยนตำแหน่ง จะทำให้อัตราการไหลของ carrier gas เปลี่ยนแปลงไป ส่งผลให้เส้น base line มีการเปลี่ยนแปลงเกิดเป็นรูปร่างแบบพีคขึ้นมาได้ เรื่องนี้ทางกลุ่มเราประสบตอน set เครื่อง GC-2014 FPD และ GC-2014 ECD & PDD มาแล้ว (ดูตัวอย่างได้ใน Memoir ปีที่ ๔ ฉบับที่ ๓๓๙ วันจันทร์ที่ ๒๕ กรกฎาคม ๒๕๕๔ เรื่อง "GC-2014 ECD & PDD ตอนที่ ๑๐ ผลกระทบจากการเปลี่ยนตำแหน่งของวาล์วตัวที่ ๔" และปีที่ ๔ ฉบับที่ ๓๔๐ วันพุธที่ ๒๗ กรกฎาคม ๒๕๕๔ เรื่อง "GC-2014 ECD & PDD ตอนที่ ๑๑ ผลกระทบจากการเปลี่ยนตำแหน่งของวาล์วตัวที่ ๓")

โดยทั่วไปในกรณีของ packed column พีคที่ออกมาในช่วงแรกจะมีสัดส่วนความสูงต่อความกว้างที่มาก (สูงแต่แคบ) พีคออกตามหลังมาจะมีสัดส่วนความสูงต่อความกว้างที่ลดลง (เตี้ยและอ้วน) ที่ต้องบอกว่าเป็นกรณีของ packed column ก็เพราะถ้าเป็น capillary column เรียกได้ว่าพีคมันจะคม (สูงและแคบ) ตลอดทั้งโครมาโทแกรม

ถ้ามีพีคที่มีลักษณะสัดส่วนความสูงต่อความกว้างที่มาก แทรกอยู่ระหว่างหรือตามหลังพีคที่มีสัดส่วนความสูงต่อความกว้างที่ต่ำกว่า ก็น่าสงสัยว่ามีอะไรบางอย่างหลุดเข้าไปในคอลัมน์ภายหลังจากที่ฉีดตัวอย่างเข้าไปแล้ว

ถ้ามีพีคที่มีลักษณะสัดส่วนความสูงต่อความกว้างที่ต่ำ ปรากฏอยู่ระหว่างหรือปรากฎเป็นฐานให้กับพีคที่มีสัดส่วนความสูงต่อความกว้างที่มากที่ออกมาในช่วงต้น ก็น่าสงสัยว่าคงมีบางอย่างตกค้างอยู่ในคอลัมน์จากการวิเคราะห์ก่อนหน้า แต่เพิ่งจะมาออกเอาตอนนี้

ตัวอย่างที่เคยเจอมา

(ก) พีคเล็ก ๆ ลักษณะพีคได้สัดส่วน ออกมาเอาแน่เอานอนไม่ได้ ไม่ขึ้นกับอุณหภูมิคอลัมน์ เคยพบว่าปัญหาอยู่ที่ septum ทนอุณหภูมิไม่ได้ (ดู Memoir ปีที่ ๖ ฉบับที่ ๖๔๑ วันอังคารที่ ๙ กรกฎาคม ๒๕๕๖ เรื่อง "สารพัดปัญหา GC (การทำวิทยานิพนธ์ภาคปฏิบัติ ตอนที่ ๔๘)")

(ข) พีคใหญ่ป้าน ๆ ออกมาที่อุณหภูมิสูง เกิดจากสารที่ตกค้างในคอลัมน์ที่เกิดจากการฉีดครั้งก่อนหน้า (บางทีเกิดจากคนที่ทดลองเอาไว้ก่อน) พวกนี้ที่เคยเจอเกิดจากการตั้งอุณหภูมิคอลัมน์ต่ำเกินไป เลยตกค้างอยู่ในคอลัมน์ ใช้เวลานานในการเคลื่อนตัวออก ทำให้ผู้วิเคราะห์คิดว่าสารนั้นออกมาหมดแล้ว ทั้ง ๆ ที่ยังมีค้างอยู่ ปัญหานี้แก้ได้ด้วยการ regenerate column คือเปิด oven ทิ้งไว้ที่อุณหภูมิสูง (โดยที่คอลัมน์ยังทนได้) เพื่อไล่สารตกค้างออกมาให้หมด (ดู Memoir ปีที่ ๒ ฉบับที่ ๘๓ วันอังคารที่ ๑ ธันวาคม ๒๕๕๒ เรื่อง "เกิดขึ้นตอนกี่โมง")

(ค) นิสิตใช้ solvent ล้างเข็ม แต่ก่อนฉีดตัวอย่างไม่ได้ใช้สารตัวอย่างล้าง solvent ออกให้หมด ทำให้มีพีค solvent ปรากฏในโครมาโทแกรม (ดู Memoir ปีที่ ๕ ฉบับที่ ๕๙๗ วันพุธที่ ๒๗ มีนาคม ๒๕๕๖ เรื่อง "เมื่อ GC มีพีคประหลาด (การทำวิทยานิพนธ์ภาคปฏิบัติ ตอนที่ ๔๕)")

(ง) พีคประหลาดเกิดระหว่างการทำ calibration curve ที่เกิดจากการเจือจางสารด้วยน้ำกลั่น คือเอาสารบริสุทธิ์มาฉีดจะเห็นพีคเดียว แต่พอเจือจางในน้ำกลับเห็นมีหลายพีค ในกรณีนี้พอตรวจสอบกลับไปที่น้ำกลั่นพบว่าน้ำกลั่นที่นำมาเจือจางนั้นมีการปนเปื้อน (ดู Memoir ปีที่ ๕ ฉบับที่ ๕๙๗ วันพุธที่ ๒๗ มีนาคม ๒๕๕๖ เรื่อง "เมื่อ GC มีพีคประหลาด (การทำวิทยานิพนธ์ภาคปฏิบัติ ตอนที่ ๔๕)")

ในกรณีที่เขาถามมานี้ ผมคงให้ความเห็นได้แค่ว่า อาจลองตรวจสอบดูว่า

(๑) ถ้าสงสัยว่าเป็นที่ septum ก็อาจตรวจสอบเบื้องต้นก่อนโดยลดอุณหภูมิของ injector port ให้ต่ำกว่าอุณหภูมิ "สูงสุด" ที่ septum ทนได้ เพราะถ้าตอนแรกตั้งอุณหภูมิไว้สูงมากเกินไป แม้ว่าลดอุณหภูมิลงมาแล้วแต่ก็ยังสูงกว่าอุณหภูมิสูงสุดที่ septum ทนได้ ก็อาจยังมีปัญหาอีก ถ้าเป็นกรณีนี้เมื่อลดอุณหภูมิให้ต่ำลงมากพอ ปัญหาก็จะหายไป

(๒) ตำแหน่งที่มันปรากฏนั้น เป็นตำแหน่งซ้ำเดิม ๆ หรือไม่ เช่นถ้ามีปรากฏที่อุณหภูมิ/เวลาใดก็จะเกิดที่อุณหภูมิ/เวลานี้ตลอด ลักษณะเช่นนี้ทำให้สงสัยว่าพีคนั้นมันเข้ามาพร้อมกับตัวอย่างที่ฉีดเข้ามา

(๓) ทำการวิเคราะห์ปรกติ โดย "ไม่ต้องฉีด" สารตัวอย่าง แล้วดูว่ามีพีคดังกล่าวหรือไม่ ถ้าไม่มีแสดงว่าปัญหาอยู่ที่สารตัวอย่าง แต่ถ้ายังมีอยู่ก็แสดงว่าปัญหาไม่ได้อยู่ที่ตัวอย่าง แต่น่าจะเป็นสิ่งที่มากับ carrier gas ของเครื่อง

อีกรายถามมาเมื่อวันอังคารที่ ๓๑ กรกฎาคม ถามมาสั้น ๆ แค่สองบรรทัดแค่นี้ครับ

1. พีคที่เคยรัน conditionเดิม แต่อยู่ พีคที่เคยsharp ก้อ board นี่เปนเพราะอะไรคะ

2. รันอยู่ดีมาทั้งวัน พอตกเย็น พีคฝั่งtcd หายไปเรียบสนิทเลยค่ะ

ในกรณีเช่นนี้เนื่องจากให้ข้อมูลมาน้อยมาก ยากที่จะระบุสาเหตุที่เป็นไปได้ จึงพอจะให้คำแนะนำได้แค่ (จากประสบการณ์ที่เคยเจอ)

1. ปรกติถ้าที่โปรแกรมอุณหภูมิคอลัมน์เหมือนเดิม

1.1 ความเร็วในการออกมาของพีคจะขึ้นอยู่กับอัตราการไหลของ carrier gas ถ้า carrier gas ไหลเร็วพีคก็จะออกมาเร็ว ถ้า carrier gas ไหลช้าพีคก็จะออกมาช้า

1.2 พีคที่ออกมาเร็วมักจะคมกว่าพีคที่ออกมาช้า (พีคที่ออกมาช้าจะมีสัดส่วนความสูงต่อความกว้างที่ต่ำกว่า)

1.3 ในกรณีนี้พีคที่ออกมา broad มากขึ้นนั้นต้องไปดูด้วยว่าออกมาช้าลงกว่าเดิมหรือเปล่า (มันควรจะเป็นเช่นนั้น) ถ้าเป็นเช่นนี้แสดงว่า carrier gas flow rate ที่ไหลผ่าน column นั้นลดลง

1.4 การที่ carrier gas flow rate ไหลผ่าน column นั้นลดลงมีได้หลายสาเหตุ เท่าที่เคยเจอก็มี (สมมุติว่าไม่มีใครไปยุ่งกับ carrier gas จากถังที่ป้อนเข้า GC)

(ก) มีการรั่วที่บริเวณ septum ในกรณีนี้จะเห็นพีคออกมาช้าลง และพื้นที่น้อยลง แม้ว่าจะฉีดตัวอย่างเท่าเดิม เพราะสารตัวอย่างรั่วออกไปกับแก๊สที่รั่วออกทาง septum ทำให้ปริมาณที่เข้าคอลัมน์ลดลง ถ้าเป็นกรณีที่ septum ผ่านการใช้งานมานาน อาการดังกล่าวหนักขึ้นเรื่อย ๆ เพราะยิ่งแทง syringe ผ่าน septum ก็จะทำให้ septum รั่วมากขึ้น ถ้าเปลี่ยน septum อาการก็จะหายไป (ดู Memoir ปีที่ ๓ ฉบับที่ ๒๖๕ วันอังคารที่ ๑ มีนาคม ๒๕๕๔ เรื่อง "การทำวิทยานิพนธ์ภาคปฏิบัติ ตอนที่ ๑๕ เมื่อพีค GC ออกมาผิดเวลา") แต่ก็มีเหมือนกันว่า septum ปรกติดี แต่ขันนอตที่ใช้ยึด septum ไม่แน่น พอขันให้แน่นก็จะกลับมาเป็นปรกติ

(ข) packed column มีการอัดตัวกันแน่นมากกว่าเดิม ในกรณีนี้จะเห็นพีคออกมาช้าลง แต่พื้นที่พีคไม่ได้หายไป เพราะสารตัวอย่างที่ฉีดเข้าไปไม่ได้เกิดการรั่วไหล (ดู Memoir ปีที่ ๕ ฉบับที่ ๖๓๔ วันพุธที่ ๑๙ มิถุนายน ๒๕๕๖ เรื่อง "การแก้ปัญหา packing ในคอลัมน์ GC อัดตัวแน่น (การทำวิทยานิพนธ์ภาคปฏิบัติ ตอนที่ ๔๗)")

(ค) มีการรั่วตรงข้อต่อของ column กับ injector port ปัญหานี้เคยเจอกับกรณีของการต่อคอลัมน์แก้ว เพราะไม่สามารถขันให้แน่นได้เหมือนคอลัมน์โลหะ ถ้าเป็นกรณีนี้จะเห็นพีคออกมาช้าลงและมีขนาดเล็กลง แต่ถ้าเป็นการรั่วตรงข้อต่อระหว่าง column กับ detector port จะเห็นพีคออกมาที่เวลาคงเดิมแต่มีขนาดเล็กลง (ดู Memoir ปีที่ ๓ ฉบับที่ ๓๑๗ วันพุธที่ ๑๕ มิถุนายน ๒๕๕๔ เรื่อง "การทำวิทยานิพนธ์ภาคปฏิบัติ ตอนที่ ๒๑ เมื่อความแรงของพีค GC ลดลง")

2. ข้อนี้ตอบยาก เพราะสาเหตุที่พีคหายไปมีได้หลายแบบ ตั้งแต่ detector มีปัญหาจนถึงตัวอย่างที่ฉีดเข้าไปนั้นไม่มีสารที่ต้องการวัด มันก็เลยไม่มีพีคขึ้น นอกจากนี้ยังเคยมีกรณีของ base line ที่มีการ drift โดยเคลื่อนตัวต่ำลงไปเรื่อย ๆ จนทำให้ตกสเกลการวัด ในกรณีหลังนี้เคยเจอกับกรณีที่ใช้ integrator บันทึกผล คือ base line ของเครื่องนั้นลดต่ำลงจนทำให้พีคจมหายไป (ดู Memoir ปีที่ ๒ ฉบับที่ ๘๑ ศุกร์ ๒๗ มิถุนายน ๒๕๕๒ เรื่อง "ทำความรู้จักกับ Chromatogram (ตอนที่ 3)" กับ Memoir ปีที่ ๓ ฉบับที่ ๑๘๖ อาทิตย์ ๒๕ กรกฎาคม ๒๕๕๓ เรื่อง "ทำความรู้จักกับ Chromatogram (ตอนที่ ๔)")

ส่วนสาเหตุที่แท้จริงของปัญหาต่าง ๆ นั้นคืออะไร ผมก็ไม่ทราบเหมือนกัน เพราะไม่มีการแจ้งกลับมา