อันที่จริงผมเขียนเรื่องนี้เอาไว้ก่อนเรื่องที่ส่งไปให้ก่อนหน้านี้ แต่ตอนเช้าพอไปเห็นสภาพห้องแลปแล้วพบว่ามันเกินกว่าที่จะรับไหว เลยต้องออก
Memoir ฉบับที่ส่งไปก่อนหน้าเพื่อเป็นการบันทึกพฤติกรรมของผู้ปฏิบัติงานในแลปให้คนทั่วไปสามารถรับทราบได้ใน Memoir ฉบับวันอังคารที่ ๑ ธันวาคม ๒๕๕๓ เรื่อง "เกิดขึ้นตอนกี่โมง" ผมทิ้งท้ายเอาไว้ว่าจะเล่าให้ฟังเรื่องที่นิสิตผู้หนึ่งตั้งอุณหภูมิคอลัมน์ GC (Gas chromatograph) ไว้ต่ำเกินไป ทำให้มองไม่เห็นผลิตภัณฑ์ข้างเคียงที่เกิดขึ้น เห็นแต่เฉพาะผลิตภัณฑ์ที่เขาต้องการเห็น ทำให้เขาสรุปออกมาว่าผลการทดลองของเขาได้ค่า selectivity เป็น 100% แต่จากการดุลมวลสารพบว่ามีสารหายไปเป็นจำนวนมาก (ถ้าจำไม่ผิดดูเหมือนว่าในบางการทดลองจะหายไปเกือบ80%)
นี่ก็ทิ้งมาตั้ง ๖ เดือนแล้ว ก็เห็นควรว่าควรจะได้เล่าเรื่องดังกล่าวสักที เพราะเมื่อสัปดาห์ที่แล้วก็มีคนมาถามในเรื่องเดียวกันเหมือนกันว่าทำไมผลการวิเคราะห์ GC จึงออกมาแปลก ๆ ผมก็เลยบอกให้ไปทำการทำความสะอาดคอลัมน์ GC ดูก่อน
ในการใช้เครื่อง GC นั้นเรามักจะต้องตั้งอุณหภูมิการทำงานที่ ๓ ตำแหน่งด้วยกันคือ Injector port (ที่ฉีดสารตัวอย่าง) Detector (ตัวตรวจวัด) และคอลัมน์ ในเครื่องบางรุ่นนั้น Injector port และ Detector ต่างก็มี heater ของตัวเอง ทำให้สามารถตั้งอุณหภูมิของ Injector port และ Detector ให้แตกต่างกันได้ แต่บางรุ่น (เช่นส่วนใหญ่ที่ใช้กันในแลปของเรา) จะใช้ heater ตัวเดียวให้ความร้อนทั้ง Injector port และ Detector ทำให้อุณหภูมิของ Injector port และ Detector เป็นอุณหภูมิเดียวกันเสมอ
โดยปรกติแล้ว อุณหภูมิของ Injector port ควรจะต้องสูงกว่าอุณหภูมิของสารตัวอย่างที่มีจุดเดือดสูงสุด เพื่อที่มั่นใจได้ว่าสารตัวอย่างที่เป็นของเหลวที่ฉีดเข้าไปในคอลัมน์ เกิดเป็นไอระเหยทันทีที่ฉีดเข้าไป และอุณหภูมิของ Injector port ก็มักจะสูงกว่าอุณหภูมิของคอลัมน์ด้วย แต่มีสิ่งที่ต้องระวังคือ Septum ที่ Injector port นั้นปรกติจะเป็นพอลิเมอร์ ดังนั้นต้องตรวจสอบก่อนด้วยว่า Septum ที่ใช้นั้นสามารถทนอุณหภูมิของ Injector port ที่ตั้งเอาไว้ได้
ส่วนอุณหภูมิของ Detector นั้นไม่ควรต่ำกว่าอุณหภูมิการใช้งานสูงสุดของคอลัมน์ กล่าวคือถ้าเราใช้งานคอลัมน์ที่อุณหภูมิคงที่ 170 องศาเซลเซียส เราก็ควรตั้งอุณหภูมิ Detector ไว้ไม่ต่ำกว่า 170 องศาเซลเซียส แต่ถ้าเราใช้งานคอลัมน์แบบมีการเปลี่ยนอุณหภูมิ เช่นเริ่มต้นที่ 80 องศาเซลเซียสและไปสิ้นสุดที่ 200 องศาเซลเซียส เราก็ต้องตั้งอุณหภูมิของ Detector ไว้ไม่ต่ำกว่า 200 องศาเซลเซียส
ส่วนอุณหภูมิของคอลัมน์นั้น โดยหลักก็ต้องพิจารณาก่อนว่าสารตัวอย่างที่ฉีดเข้าไปนั้น ตัวที่มีจุดเดือดสูงสุดนั้นมีอุณหภูมิจุดเดือดเท่าใด แต่ก็ไม่เสมอไปที่ว่าอุณหภูมิของคอลัมน์จะต้องสูงกว่าอุณหภูมิจุดเดือดของสารที่ต้องการแยก เพราะยังขึ้นอยู่กับกลไกที่คอลัมน์ใช้ในการแยกสาร และคุณสมบัติของสารนั้น
โดยทั่วไปการแยกสารในคอลัมน์ GC อาจเกิดจาก (เฉพาะส่วนที่ใช้ในแลปของเรา)
(ก) จุดเดือดที่แตกต่างกัน กรณีเช่นนี้มักพบในกรณีการแยกสารประกอบไฮโดรคาร์บอน (ซึ่งไม่มีขั้ว) สารที่มีจุดเดือดต่ำมักจะออกมาก่อนจุดเดือดสูง
(ข) ความเป็นขั้วของโมเลกุล คอลัมน์บางชนิดออกแบบมาเพื่อจับโมเลกุลที่เป็นขั้ว ส่วนโมเลกุลที่ไม่มีขั้วจะเคลื่อนผ่านออกมาได้เร็ว
(ค) รูปร่าง/ขนาดของโมเลกุล
ปัญหามักเกิดขึ้นเมื่อเราไม่รู้ว่าสารตัวอย่างที่เราฉีดเข้าไปนั้นมีสารใดบ้าง หรือเราไม่ได้คาดการณ์ไว้ว่ายังมีสารอื่นอีกที่จะออกมาหลังจากสารที่เราต้องการวิเคราะห์ เรื่องที่เกิดขึ้นในครั้งนั้นคือกรณีของปฏิกิริยาระหว่างเบนซีนกับไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์เพื่อผลิตฟีนอล
ปัญหาที่เกิดคือผู้ทำการทดลองมักคิดว่าปฏิกิริยาจะเกิดการแทนที่เพียงครั้งเดียว (คือเกิดแค่ฟีนอล) แต่ในความเป็นจริงนั้นเนื่องจากหมู่ -OH เป็น ring activating group จึงทำให้มีโอกาสเกิดการแทนที่ครั้งที่สองที่ตำแหน่ง ortho และ para ได้อีก ถ้าแทนที่ครั้งที่สองที่ตำแหน่ง ortho ก็จะได้ Catechol และถ้าแทนที่ครั้งที่สองที่ตำแหน่ง para ก็จะได้ Hydroquinone
นอกจากนี้ Hydroquinone ยังถูกออกซิได้ต่อได้ง่ายกลายเป็น Benzoquinone และในระบบการทำปฏิกิริยานั้นก็มีสารออกซิไดซ์ (คือไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์อยู่ในระบบด้วยอยู่แล้ว) เนื่องจากสารที่เกิดจากการแทนที่ครั้งที่สองนั้นมีจุดหลอมเหลวและจุดเดือดสูงกว่าฟีนอล (ดูรูปข้างล่าง) ดังนั้นถ้าตัวอย่างของเรามีสารเหล่านี้ปนอยู่ และเราใช้อุณหภูมิคอลัมน์ที่สูงมากพอ สารเหล่านี้ก็จะออกมาจากคอลัมน์หลังจากที่ฟีนอลหลุดพ้นมาแล้ว แต่ถ้าเราตั้งอุณหภูมิคอลัมน์สูงไม่มาก (คือแค่ทำให้ฟีนอลหลุดออกมาจากคอลัมน์ได้เท่านั้น) สารเหล่านี้ก็จะตกค้างและสะสมอยู่ในคอลัมน์ และเมื่อตกค้างอยู่มาก ๆ ก็อาจทำให้เกิดปัญหาการปรับ base line ไม่ได้ หรือคอลัมน์ไม่สามารถแยกสารได้ (เพราะมีสารอื่นเกาะอยู่จนอิ่มตัวไปหมดแล้ว)
บ่อยครั้งที่พบว่าสารตัวอย่างก็อาจหลุดออกมาจากคอลัมน์ได้ทั้ง ๆ ที่อุณหภูมิคอลัมน์ไม่ได้สูงกว่าอุณหภูมิจุดเดือดของสาร ทั้งนี้อาจเป็นเพราะสารที่บรรจุอยู่ในคอลัมน์นั้นไม่ได้ดูดซับสารตัวอย่างไว้อย่างแน่นหนา (เช่นใช้ความเป็นขั้วที่แรงจับเอาไว้) และความดันไอของสารตัวอย่างในคอลัมน์ก็ต่ำกว่าความดันไออิ่มตัวของสารตัวอย่างที่อุณหภูมินั้น (แบบเดียวกับการที่เรามีไอน้ำอยู่ในอากาศได้ทั้ง ๆ ที่อุณหภูมิอากาศต่ำกว่าอุณหภูมิจุดเดือดของน้ำ)
การแทนที่ครั้งที่สองของปฏิกิริยาที่ยกมาเป็นตัวอย่างนั้นเกิดได้ "แต่" เกิดได้ไม่มาก ทั้งนี้เป็นเพราะคุณสมบัติของพื้นผิวตัวเร่งปฏิกิริยาที่ไม่ชอบสารที่โมเลกุลมีความเป็นขั้ว ดังนั้นแม้ว่า -OH จะเป็น ring activating group แต่การเกิดปฏิกิริยาดังกล่าวฟีนองที่เกิดขึ้นจากการแทนที่ครั้งแรกต้องสามารถเกาะอยู่บนพื้นผิวได้ (เพราะปฏิกิริยานี้จะเกิดได้ก็ต่อเมื่อมีตัวเร่งปฏิกิริยาช่วย) แต่เนื่องจากพื้นผิวตัวเร่งปฏิกิริยาไม่ชอบสารที่โมเลกุลมีความเป็นขั้ว ฟีนอล (อันที่จริงก็รวมถึงไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ด้วย) จึงถูกผลักออกจากพื้นผิว ทำให้การแทนที่ครั้งที่สองเกิดได้น้อยลงไปมาก
จริงอยู่แม้ว่าเบนซีนจะไม่ทำปฏิกิริยากับไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์เมื่อไม่มีตัวเร่งปฏิกิริยา แต่ก็ไม่ได้หมายความว่าจะไม่เกิดปฏิกิริยาระหว่างฟีนอลกับไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์โดยตรงในสารละลายโดยไม่ต้องพึ่งตัวเร่งปฏิกิริยา ปฏิกิริยาระหว่างฟีนอลและไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์โดยตรง (ไม่มีตัวเร่งปฏิกิริยา) ก็ต้องตรวจสอบด้วย เพราะฟีนอลมีความว่องไวในการทำปฏิกิริยามากกว่าเบนซีน
การทำความสะอาดคอลัมน์ GC ทำได้โดยการให้ความร้อนแก่คอลัมน์ที่อุณหภูมิสูงต่อเนื่องเป็นเวลานาน คำถามแรกที่ถามกันก็คือควรใช้อุณหภูมิสูงเท่าใด ขีดจำกัดของอุณหภูมิที่ใช้ได้คืออุณหภูมิสูงสุดที่คอลัมน์ทนได้ แต่ทั้งนี้ก็ไม่ได้หมายความว่าต้องทำความสะอาดคอลัมน์โดยใช้อุณหภูมิสูงสุดที่คอลัมน์ทนได้ ตัวอย่างเช่นคอลัมน์ทนอุณหภูมิได้สูงสุด 260 องศาเซลเซียส แต่ที่ผ่านมาเราใช้งานคอลัมน์ที่อุณหภูมิสูงเพียงแค่ 180 องศาเซลเซียส เราก็อาจทดลองทำความสะอาดคอลัมน์โดยตั้งอุณหภูมิ oven ไว้ที่ 180 องศาเซลเซียสแล้วเปิดเครื่องทิ้งไว้ คอยดูสัญญาณที่ส่งออกมาจาก detector ว่ามีสัญญาณออกมาหรือไม่ ถ้า detector ส่งสัญญาณออกมา (อาจอยู่ในรูปแบบของสัญญาพื้นหลัง (background) ที่ออกมาตลอดเวลา หรือมีพีคโผล่ออกมาเป็นระยะ) แสดงว่ามีสารตกค้างอยู่ในคอลัมน์ หรือถ้าไม่แน่ใจก็อาจใช้อุณหภูมิที่สูงขึ้นอีกเล็กน้อย เช่นใช้ 200 องศาเซลเซียส การทำความสะอาดคอลัมน์จะทำไปเรื่อย ๆ จนกว่าพบว่าไม่มีสารออกมาจากคอลัมน์
สิ่งที่ต้องระวังคือคำว่า "ไม่มีสารออกมาจากคอลัมน์" ในที่นี้ไม่ได้หมายความว่าเห็นสัญญาณที่ detector ส่งออกมานั้น "นิ่ง" เพราะมีบางครั้งเหมือนกันที่สัญญาณที่ detector ส่งออกมานั้นมันเกิดการอิ่มตัว ทั้งนี้เป็นเพราะสารออกมามากเกินกว่าที่ detector จะวัดได้ จึงแสดงเพียงแค่ค่าสูงสุดที่ detector วัดได้เท่านั้น (พวกที่มากกว่านั้นจะมองไม่เห็น) ซึ่งเหตุการณ์ดังกล่าวก็ทำให้เห็นว่าสัญญาณมัน "นิ่ง" เช่นเดียวกัน อีกกรณีหนึ่งที่อาจทำให้เห็นสัญญาณ "นิ่ง" ได้คือการตั้ง attenuation ของเครื่องไว้สูงมากเกินไป จนมันลบการเปลี่ยนแปลงทั้งหมดให้เหลือน้อยมากจนสังเกตไม่เห็น ถ้าคอลัมน์สะอาดและ detector สะอาดจริง แม้ว่าเราจะตั้ง attenuation ไว้ต่ำสุด (คือไม่มีการตัดสัญญาณเลย) ก็จะพบว่าสัญญาณจะ "นิ่ง" จริง ๆ กรณีสุดท้ายนี้จำเป็นมากเมื่อต้องวิเคราะห์ตัวอย่างในปริมาณน้อย ๆ
ฉบับต่อไปจะเล่าเรื่องเกี่ยวกับการเตรียมคอลัมน์ใหม่ให้พร้อมใช้งาน เพราะตอนนี้เราได้คอลัมน์ใหม่ที่มากับเครื่อง GC เครื่องใหม่ เหตุผลที่แยกเรื่องออกไปก็เพื่อให้ค้นหาเนื้อหาได้ง่ายภายหลัง
ไม่มีความคิดเห็น:
แสดงความคิดเห็น